Involvement of NF-κB activation in the apoptosis induced by extracellular adenosine in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

Adenosine can exhibit cytotoxic activity in vivo and in vitro, though its mechanisms are still uncertain. In this study, we investigated the adenosine-mediated apoptotic signaling pathway and the role of NF-κB in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells. HepG2 cells were treated with different concentrations of adenosine for 12-48 h, and the effect of adenosine on cell proliferation was evaluated by MTT assay. The cytotoxicity of adenosine alone or in combination with an NF-κB inhibitor, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), was also evaluated by MTT assay and the mode of cell death was detected by Hoechst 33342 staining. Cell cycle progress was performed by flow cytometry with PI staining. The protein expressions of Bcl-2, p53, NF-κB subunit p65, and caspase-3 were assayed by Western blot. Caspase-3 activity was measured by spectrophotomteric assay. The results showed that adenosine significantly reduced the viability of HepG2 cells in a dose- and time-dependent manner, with IC ₅₀ (24 and 48 h) of 2.52 and 1.89 mmol·L^-1, respectively. The apoptotic index (percentage of sub-G₁ phase) of HepG2 cells in adenosine treatment alone for 12 and 24 h or in combination with PDTC were 8.30%, 22.32% and 20.18%, 30.89%, respectively. All of them were higher than that in the control group (0.81%, p < 0.01). The characteristic changes of cell apoptosis (chromatin condensation and sub-G₁ peak) were observed under fluorescent microscopy and flow cytometry. We also found that the apoptotic process triggered by adenosine was involved in G₀-G₁ cell-cycle arrest, enhanced the activity of caspase-3, upregulated p53 and NF-κB p65 expression, and downregulated Bcl-2 expression. Inhibition of NF-κB by PDTC decreased NF-κB p65 expression, enhanced cell apoptosis ratio, and increased caspase-3 activity. NF-κB may play an anti-apoptosis role in adenosine-induced HepG2 cytotoxicity.

L’adénosine peut exercer une activité cytotoxique in vivo et in vitro mais son mécanisme d’action demeure incertain. Dans cette étude, nous avons examiné la voie de signalisation de l’apoptose causée par l’adénosine ainsi que le rôle du facteur NF-κB dans les cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2. Les cellules HepG2 ont été traitées avec différentes concentrations d’adénosine pendant 12-48 h, et l’effet de l’adénosine sur la prolifération cellulaire a été évalué par un dosage au MTT. La cytotoxicité de l’adénosine seule ou combinée à un inhibiteur du NF-κB, le pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) a aussi été évaluée par un dosage MTT, et le mode de mort cellulaire a été détecté par coloration au Hoechst 33342. La progression du cycle cellulaire a été suivie par cytométrie de flux après coloration à l’iodure de propidium. L’expression de Bcl-2, p53, de la sous-unité p65 du NF-κB et de la caspase-3 a été détectée par buvardage Western. L’activité de la caspase-3 a été mesurée à l’aide d’une mesure spectrophotométrique. Les résultats ont montré que l’adénosine réduisait de façon significative la viabilité des cellules HepG2 de manière dépendante de la concentration et du temps, avec des CI₅₀ (24 et 48 h) de 2.52  et 1.89 mmol·L^-1, respectivement. Les indices d’apoptose (pourcentage de cellules en phase sub-G1) des cellules HepG2 traitées à l’adénosine seule pendant 12 ou 24 h, ou combinée au PDTC étaient de 8.30% et 22.32%, et 20.18% et 30.89%, respectivement. Ils étaient tous supérieurs à l’indice du groupe contrôle (0.81%, p < 0.01). Les changements caractéristiques de l’apoptose (condensation de la chromatine et pic en sub-G₁) ont été observés par microscopie en fluorescence et par cytométrie de flux. Nous avons aussi trouvé que le processus d’apoptose enclenché par l’adénosine était impliqué dans l’arrêt du cycle cellulaire en G₀-G₁, augmentait l’activité de la caspase-3, augmentait l’expression de p53 et de la sous-unité p65 du NF-κB, et diminuait l’expression de Bcl-2. L’inhibition du NF-κB par le PDTC augmentait la cytotoxicité, l’indice d’apoptose et l’activité de la caspase-3, et diminuait l’expression de p65. L’inhibition du NF-κB pourrait augmenter l’apoptose à travers la voie de la caspase-3 et de Bcl-2. NF-κB peut jouer un rôle anti-apoptose dans la cytotoxicité induite par l’adénosine dans les cellules HepG2.