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Open Access Detection of egg drop syndrome virus antigen or genome by enzyme-linked immunosorbent assay or polymerase chain reaction

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Mouse monoclonal antibodies (mAbs) were produced against an Indian isolate of egg drop syndrome (EDS) virus and characterized. Four hybridoma clones were secreting mAbs that bound to a 100 kDa protein, presumably the hexon protein. These mAbs were found to cross-react with two other Indian isolates of EDS virus and to the reference UK 127 strain. Three of these mAbs were mapped to the same epitope compared with the other mAb (F8), which bound to a different epitope. An antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay (AC-ELISA) was developed using the F8 mAbs as capture antibody and polyclonal chicken serum against EDS virus as detection antibody. A polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the EDS viral genome. Following experimental infection of oestrogen-treated chickens with EDS virus, cloacal swabs, oviduct, uterus and spleen were collected at different days post-infection and used in both AC-ELISA and PCR, directly and after a single passage in embryonated duck eggs. The sensitivity and specificity of antigen detection by AC-ELISA or PCR was 95% and 98%, respectively. For diagnosis of EDS viral infections, PCR is recommended due to its ease and the lack of requirement of prepared reagents such as mAbs or conjugates. We recommend that PCR be performed directly on boiled tissue homogenates. Any negative samples may be passaged in embryonated duck eggs and the allantoic fluids tested by PCR before a conclusive negative diagnosis is given.

RÉSUMÉ

Détection de l'antigène ou du génome du virus de la maladie des œufs hardés par un essai immunoadsorption à enzyme conjuguée ou par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase

Des anticorps monoclonaux (Mabs) ont été produits sur souris vis à vis d'une souche indienne de virus de la maladie des œufs hardés (EDS) et ont été caractérisés. Quatre clones d'hybridomes ont produit des Mabs qui se sont fixés à une protéine de 100 KDa, présumée être la protéine de l'hexon. Il a été mis en évidence que ces Mabs réagissaient avec deux autres souches indiennes d'EDS et avec la souche de référence UK 127. Trois de ces Mabs correspondaient au même épitope comparés à un autre Mab F8 qui se fixait sur un épitope différent. Un essai d'immunoadsorption à enzyme conjuguée, de capture antigénique (AC.ELISA) a été développé en utilisant le Ab F8 comme anticorps de capture et un sérum polygonal de poulet anti virus EDS. Un essai d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) a été utilisé pour détecter le génome viral de l'EDS. Des poulets traités aux œstrogènes ont fait l'objet d'une infection expérimentale par le virus de l'EDS. Des écouvillonnages cloacaux et des prélèvements d'oviducte, d'utérus et de rate ont été réalisés différents jours après l'infection et utilisés directement ou après un passage sur œufs embryonnés de cane dans les tests AC-ELISA et PCR. La sensibilité et la spécificité de la détection de l'antigène par AC-ELISA ou PCR a été respectivement de 95% et de 98%. Pour le diagnostic des infections virales par l'EDS, la PCR est recommandée du fait de sa facilité et de l'absence de recommandations pour les réactifs préparés tels les conjugués ou les Mabs. Nous recommandons que la PCR soit directement réalisée à partir de broyât de tissu bouilli. Tout échantillon négatif doit être passé sur œufs embryonnés, et les liquides allantoïdiens testés par PCR, avant de conclure à un résultat négatif.

ZUSAMMENFASSUNG

Nachweis von Antigen oder Genom des Egg Drop Syndrom Virus mittels Enzymimmunoassay oder Polymerasekettenreaktion

Monoklonale Antikörper (Mabs) wurden in der Maus gegen ein indisches Isolat des Egg Drop Syndrom (EDS)-Virus produziert und charakterisiert. Vier Hybridomklone sezernierten Mabs, die an ein 100 Kda-Protein, wahrscheinlich das Hexon-Protein, banden. Es wurde festgestellt, dass diese Mabs mit zwei anderen indischen Isolaten des EDS-Virus und mit dem Referenzstamm UK 127 kreuzreagierten. Drei dieser Mabs wurden dem gleichen Epitop zugeordnet, während beim Vergleich der vierte Mab (F8) mit einem anderen Epitop reagierte. Ein Antigen-Capture-Enzymimmunoassay (AC-ELISA) wurde entwickelt, wobei der F8-Mab als Fängerantikörper und polyklonales Hühnerserum gegen EDS-Virus als Nachweisantikörper verwendet wurden. Eine Polymerasekettenreaction (PCR) wurde angewendet um EDS-Virusgenom nachzuweisen. Nach experimenteller Infektion von Östrogen-behandelten Hühnern mit EDS-Virus wurden Kloakentupfer, Ovidukt, Uterus und Milz an verschiedenen Tagen nach der Infektion entnommen und direkt oder nach einer Passage in embryonierten Enteneiern sowohl im AC-ELISA als auch in der PCR getestet. Die Sensitivität und Spezifität für den Antigennachweis betrug 95% beim AC-ELISA und 98% bei der PCR. Für die Diagnose von EDS-Virusinfektionen wird wegen ihrer Einfachheit und wegen des fehlenden Bedarfs an präparierten Reagentien wie Mabs oder Konjugaten die PCR befürwortet. Wir empfehlen, die PCR direkt mit gekochten Organhomogenaten durchzuführen. Negative Proben können in embryonierten Enteneiern passagiert werden und die Allantoisflüssigkeiten in der PCR getestet werden, bevor eine endgültig negative Diagnose gestellt wird.

RESUMEN

Detección del antígeno o del genoma del virus del síndrome de caída de la puesta mediante un enzimainmunoensayo o una reacción en cadena de la polimerasa

Se produjeron y caracterizaron anticuerpos monoclonales en ratón (Mabs) frente a un aislado indio del virus del síndrome de caída de la puesta (EDS). Cuatro clones de hibridoma secretaron Mabs que se unieron a una proteína de 100 KDa, presumiblemente la proteína hexon. Estos Mabs presentaron reacción cruzada con otros dos aislados indios de virus del EDS y con la cepa de referencia UK 127. Tres de estos Mabs se unieron al mismo epítopo mientras que el restante Mab (F8), se unió a un epítopo diferente. Se desarrolló un enzimainmunoensayo de captura (AC-ELISA) con el Mab F8 como anticuerpo de captura y antisuero policlonal de pollo frente al virus de EDS como anticuerpo de detección. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó para detectar el genoma vírico del EDS. Tras la infección experimental de pollos tratados con estrógenos con virus del EDS, se recogieron hisopos cloacales, oviducto, útero y bazo a diferentes días post-infección y fueron utilizados tanto en el AC-ELISA como en la PCR, directamente y tras un pase en huevos de pato embrionados. La sensibilidad y especificidad de la detección del antígeno mediante AC-ELISA o PCR fue del 95% y 98% respectivamente. Para el diagnóstico de las infecciones víricas por EDS, se recomienda la PCR dado que es una técnica fácil y que no requiere reactivos preparados como los Mabs o conjugados. Nosotros recomendamos que la PCR se realice directamente a partir de homogenizados hervidos de tejido. Cualquier muestra negativa debe ser inoculada en huevos de pato embrionados y el líquido alantoideo probado mediante PCR antes de dar un diagnóstico definitivo de negatividad.
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Document Type: Research Article

Publication date: October 1, 2003

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