Resting Ca²⁺ influx does not contribute to anoxia-induced cell death in adult rat cardiac myocytes

Calcium has been proposed as a primary influence on cell death during ischemic episodes in myocardial cells. One component of calcium entry into a cell is resting calcium influx. This basal movement of calcium is blocked by 100 µmol/L gadolinium chloride (GdCl₃) in cardiac myocytes. Therefore, GdCl₃ should be cardioprotective under anoxic conditions. To test this, cardiac myocytes isolated from adult male rats were subjected to anoxia (100% N₂) in the presence or absence of 100 µmol/L GdCl₃ in one of 2 ways. In the first method, cells were suspended in media and rendered anoxic for 0, 30, and 60 min, after which cell morphology and viability were scored. After 60 min of anoxia, rod-shaped cells accounted for 46% ± 4% of total cells (viability 81%); 10 min of reoxygenation markedly reduced rod-shaped cells to 27% (viability 72%). GdCl₃ in the medium did not protect the cells (anoxic rods 49%, reoxygenated rods 30%, viability 77%). In the second method, cells were attached to a laminin substrate, rendered anoxic, and then videotaped for up to 6 h. In this system, cells maintained their shape for some time after the onset of anoxia, and then began to ‘die’ (i.e., to take on either a rigor form or hypercontracted form) at a measurable rate. Time to onset of ‘death’ (t ₀), time to 50% and 100% ‘death’ (t ₅₀ and t ₁₀₀), and rate of ‘death’ were used to measure anoxic damage. Without GdCl₃, cells on average began to die 115 ± 32 min after the onset of anoxia (t ₀); they died at an average rate of 0.046 cells/min. t ₅₀ was achieved in 149 ± 42 min, t ₁₀₀ in 183 ± 54 min. Addition of 100 µmol/L GdCl₃ did not affect any of these parameters. We concluded that GdCl₃ was not cardioprotective for anoxic myocytes and that cell damage generated by anoxia could not be attributed to resting calcium influx.

Le calcium aurait une influence imporante sur la mort cellulaire durant des épisodes d’ischémie dans les cellules myocardiques. Une composante de l’entrée de calcium dans une cellule est le courant calcique entrant au repos. Ce mouvement basal de calcium est bloqué par 100 µmol/L de chlorure de gadolinium (GdCl₃) dans les myocytes cardiaques. Par conséquent, le GdCl₃ devrait avoir un effet cardioprotecteur dans des conditions anoxiques. Pour vérifier cette hypothèse, on a soumis des cardiomyocytes isolés de rats mâles adultes à une anoxie (100 % N₂) en présence ou en l’absence de 100 µmol/L de GdCl₃, en utilisant deux méthodes. Dans la première méthode, les cellules ont été suspendues dans des solutions et rendues anoxiques pendant 0, 30, et 60 min; la morphologie et la viabilité des cellules ont ensuite été notées. Après 60 min d’anoxie, les cellules en bâtonnet ont représenté 46 % ± 4 % de la totalité des cellules (viabilité 81 %); une réoxygénation pendant 10 min a réduit de façon marquée le nombre de cellules en bâtonnet à 27 % (viabilité 72 %). La présence de GdCl₃ dans la solution n’a pas protégé les cellules (bâtonnets anoxiques 49 %, bâtonnets réox. 30 %, viabilité 77 %). Dans la seconde méthode, les cellules ont été fixées sur un substrat de laminine, rendues anoxiques, puis leur comportement a été enregistré sur bande vidéo pendant une période allant jusqu’à 6 h. Dans ce système, les cellules ont maintenu leur forme quelque temps après le début de l’anoxie, puis ont commencé à « mourir » (c.-à-d. à prendre une forme soit rigide, soit hypercontractée) à un taux mesurable. Le temps vers le début de la « mort » t ₀, le temps vers une « mortalité » de 50 % et de 100 % (t ₅₀ et t ₁₀₀) et le taux de « mortalité » ont été utilisés pour mesurer la lésion anoxique. Sans GdCl₃, les cellules en moyenne ont commencé à « mourir » 115 ± 32 min après le déclenchement de l’anoxie (t ₀); les cellules sont « mortes » à un taux moyen de 0,046 cellules/min. t ₅₀ a été atteint en 149 ± 42 min, t ₁₀₀ en 183 ± 54 min. L’ajout de 100 µmol/L de GdCl₃ n’a influé sur aucun de ces paramètres. Nous avons conclu que le GdCl₃ n’a pas eu d’effet cardioprotecteur sur les myocytes anoxiques et que l’altération des cellules causée par l’anoxie ne pouvait être attribuée à un courant entant de calcium au repos.