Conversion of renin substrate tetradecapeptide to angiotensin II by rat MAB elastase-2

A new approach for the purification of rat mesenteric arterial bed (MAB) elastase-2 has been developed using the chromogenic substrates N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide and N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide to monitor the enzymatic activity during various stages of purification. The purified enzyme was evaluated in the presence of various inhibitors and confirmed to have angiotensin (Ang) II-forming ability. The active site-directed inhibitor acetyl-Ala-Ala-Pro-Leu-chloromethylketone (100 µmol·L^-1), described for human pancreatic elastase-2, abolished the enzymatic activity, confirming that the enzyme is an elastase-2. Chymostatin (100 µmol·L^-1), an inhibitor regarded as selective for chymases, also showed a remarkable inhibitory effect (94%), whereas captopril (100 µmol·L^-1) had no effect at all on the Ang II-forming activity. The Ang II precursor renin substrate tetradecapeptide (RS-14P) was converted into Ang II by the rat MAB elastase-2 with the following kinetic constants: K _m = 124 ± 21 µmol·L^-1; K _cat = 629 min^-1; catalytic efficiency (K _cat /K _m) = 5.1 min^-1 µ(mol/L)^-1. In conclusion, the strategy for the purification of rat MAB elastase-2 with the chromogenic substrates proved to be simple, rapid, accurate, and highly reproducible; therefore, it can be reliably and conveniently used to routinely purify this enzyme. The kinetic parameters for the formation of Ang II from RS-14P by rat MAB elastase-2 emphasize differences in substrate specificity between this and other Ang II-forming enzymes.Key words: N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide, elastase-2, angiotensin II, renin substrate tetradecapeptide.

Une nouvelle approche, mise au point pour la purification de l'élastase-2 du lit artériel mésentérique (LAM) du rat, consiste à utiliser les substrats chromogènes, N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide et N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide, pour visualiser l'activité enzymatique durant diverses étapes de la purification. La capacité de l'enzyme purifiée à former l'angiotensine (Ang) a été évaluée en présence de divers inhibiteurs et confirmée. L'inhibiteur dirigé vers le site actif, acétyl-Ala-Ala-Pro-Leu-chlorométhylcétone (100 µmol·L^-1), décrit pour l'élastase-2 pancréatique humaine, a supprimé l'activité enzymatique, confirmant que l'enzyme est une élastase-2. La chymostatine (100 µmol·L^-1), un inhibiteur considéré comme étant sélectif des chymases, a aussi montré un effet inhibiteur remarquable (94 %), alors que le captopril (100 µmol·L^-1) n'a eu aucun effet sur l'activité formant l'Ang II. Le substrat de la rénine précurseur de l'Ang II, tétradécapeptide (RS-14P), a été converti en Ang II par l'élastase-2 du LAM de rat avec les constantes cinétiques suivantes : K _m = 124 ± 21 µmol·L^-1; K _cat = 629 min^-1; efficacité catalytique (K _cat /K _m) = 5,1 min^-1 µ(mol/L)^-1. En conclusion, la stratégie pour la purification de l'élastase-2 du LAM de rat au moyen des substrats chromogènes s'est révélée simple, rapide, précise et facilement reproductible; elle s'avère donc fiable et commode pour purifier cette enzyme sur une base régulière. Les paramètres cinétiques pour la formation de l'Ang-II par l'élastase-2 du LAM de rat à partir de RS-14P soulignent les différences dans la spécificité de substrats entre cette enzyme et d'autres enzymes formant l'Ang II.Mots clés : N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide et N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide, élastase-2, angiotensine II, substrat tétradécapeptide de la rénine.[Traduit par la Rédaction]