Functional study of intracellular P-gp- and MRP1-mediated pumping of free cytosolic pirarubicin into acidic organelles in intrinsic resistant SiHa cells

We sought to determine the efficiency of the intracellular functional P-gp- and MRP1-mediated pumping of THP into acidic organelles in SiHa cells and etoposide-resistant SiHa/VP16 cells. The expression of both MDR1 and MRP1 genes of SiHa and SiHa/VP16 cells was clearly shown by using RT–PCR. The functional studies of both intracellular functional P-gp- and MRP1-mediated pumping were performed by using THP in a conventional spectrofluorometer, and they demonstrated that SiHa and SiHa/VP16 cells are good models to illustrate the functional role of intracellular P-gp and MRP1 in the transport of free cytosolic drug into acidic organelles. The functional P-gp and MRP1 proteins were identified both on plasma membranes and on intracellular vesicle membranes. Within the limit of experimental error, similar efficiencies in THP transport were observed in the two proteins at both locations in SiHa and SiHa/VP16 cells. The P-gp- and MRP1-mediated pump coefficient (k _a ^v), Michealis–Menten's constant (K _m ^v), and maximal pumping rate (V _max ^v) values of those located on vesicular membranes were 1.87 ± 0.30 pL·cell^–1·s^–1, 1.63 ± 0.21 mM, and 4.95 ± 0.45 nM·s^–1, respectively. Drug retention inside acidic organelles (C _v ^mon) of SiHa cells was significantly higher than that of SiHa/VP16 cells, perhaps a consequence of slower movement of recycling endosomes and (or) lysosomes to the cell membrane of SiHa cells, leading to distended organelles and cell death. Our results suggest that intracellular P-gp and MRP1 proteins play an important role in the transport of free drug from cytosol to cytoplasmic acidic organelles.Key words: intrinsic resistance, multidrug resistance, intracellular functional P-glycoprotein and MRP1, acidic organelle, fluorescence spectroscopy, kinetic parameters.

Nous avons eu pour but de déterminer l'efficacité du transport de THP, véhiculé par la MRP1 et la P-gp fonctionnelles intracellulaires, dans les organites acides de la lignée cellulaire SiHa et de la lignée cellulaire résistante à l'étoposide, SiHa/VP16. L'expression des gènes MDR1 et MRP1 dans les cellules SiHa et SiHa/VP16 a été clairement démontrée par RT–PCR. Les études fonctionnelles du transport véhiculé par la P-gp et la MRP1 fonctionnelles intracellulaires, en utilisant la THP dans un spectrofluoromètre classique, ont démontré que les cellules SiHa et SiHa/VP16 sont de bons modèles pour illustrer le rôle fonctionnel de la P-gp et de la MRP1 dans le transport du médicament libre du cytosol vers les organites acides. Les protéines P-gp et MRP1 fonctionnelles ont été identifiées à la fois sur la membrane plasmique et sur la membrane vésiculaire intracellulaire. Dans la limite de l'erreur expérimentale, des efficacités similaires dans le transport de la THP ont été observées dans les deux protéines tant au niveau des cellules SiHa que des cellules SiHa/VP16. Les valeurs pour le coefficient de transport par la P-gp et la MRP1 (k _a ^v), la constante de Michaelis-Menten (K _m ^v) et la vitesse de transport maximale (V _max ^v) au niveau de la membrane vésiculaire ont été de 1,87 ± 0,30 pL·cellule^–1·s^–1, 1,63 ± 0,21 mM et 4,95 ± 0,45 nM·s^–1, respectivement. La rétention du médicament dans les organites acides (C _v ^mon) a été significativement plus élevée dans les cellules SiHa que dans les cellules SiHa/VP16, une conséquence possible d'un mouvement plus lent des endosomes et (ou) lysosomes de recyclage vers la membrane cellulaire de SiHa, qui provoque le gonflement des organites et la mort de la cellule. Nos résultats donnent à penser que les protéines P-gp et MRP1 intracellulaires jouent un rôle important dans le transport du médicament libre du cytosol vers les organites acides cytoplasmiques.Mots clés : résistance intrinsèque, multirésistance aux médicaments, glycoprotéine P et MRP1 fonctionnelles intracellulaires, organite acide, spectroscopie de fluorescence, paramètres cinétiques.[Traduit par la Rédaction]