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Nucleoplasmic calcium regulation in rabbit aortic vascular smooth muscle cells

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In this study, we investigated whether nucleoplasmic free Ca2+ in aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) might be independently regulated from cytosolic free Ca2+. Understanding mechanisms and pathways responsible for this regulation is especially relevant given the role of a numerous intranuclear Ca2+-sensitive proteins in transcriptional regulation, apoptosis and cell division. The question of an independent regulatory mechanism remains largely unsettled because the previous use of intensitometric fluorophores (e.g., Fluo-3) has been criticized on technical grounds. To circumvent the potential problem of fluorescence artifact, we utilized confocal laser scanning microscopy to image intracellular Ca2+ movements with the ratiometric fluorophore Indo-1. In cultured rabbit VSMCs, we found sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ ATPase (SERCA) pumps and ryanodine receptor (RyR) Ca2+ channel proteins to be discretely arranged within a perinuclear locus, as determined by fluorescent staining patterns of BODIPY® FL thapsi gargin and BODIPY® FL-X Ry. When intracellular Ca2+ stores were mobilized by addition of thapsigargin (5 mM) and activatory concentrations of ryanodine (1 mM), Indo-1 ratiometric signals were largely restricted to the nucleoplasm. Cytosolic signals, by comparison, were relatively small and even then its spatial distribution was largely perinuclear rather homogeneous. These observations indicate perinuclear RyR and SERCA proteins are intimately involved in regulating VSMC nucleoplasmic Ca2+ concentrations. We also observed a similar pattern of largely nucleoplasmic Ca2+ mobilization upon exposure of cells to the immunosuppressant drug FK506 (tacrolimus), which binds to the RyR-associated immunophillin-binding proteins FKBP12 and FKBP12.6. However, initial FK506-induced nucleoplasmic Ca2+ mobilization was followed by marked reduction of Indo-1 signal intensity close to pretreatment levels. This suggested FK506 exerts both activatory and inhibitory effects upon RyR channels. The latter was reinforced by observed effects of FK506 to only reduce nucleoplasmic Indo-1 signal intensity when added following pretreatment with both activatory and inhibitory concentrations of ryanodine. These latter observations raise the possibility that VSMC nuclei represent an important sink of intracellular Ca2+ and may help explain vasodilatory actions of FK506 observed by others.Key words: Ca2+, RyR, SERCA, cell nucleus, FK506, thapsigargin, ryanodine.

Dans la présente étude, nous avons examiné si Ca2+ libre nucléoplasmique pourrait être régulé indépendamment du Ca2+ libre cytoplasmique dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) aortiques. La compréhension des mécanismes et des voies responsables de cette régulation est particulièrement utile vu le rôle de nombreuses protéines sensibles au Ca2+ intranucléaire dans la régulation transcriptionnelle, l'apoptose et la division cellulaire. La question d'un mécanisme régulateur indépendant demeure toutefois en suspens étant donné que l'utilisation de fluorophores intensitométriques (p.ex. le fluo-3) a été critiquée du point de vue technique. Pour éliminer un éventuel artefact de fluorescence, nous avons eu recours à la microscopie confocale à balayage laser pour visualiser les mouvements du Ca2+ intracellulaire avec le fluorophore ratiométrique Indo-1. Dans les CMLV aortiques cultivées de lapins, nous avons observé une répartition discrète des pompes Ca2+ ATPase du réticulum sarcoplasmique (SERCA) et des protéines des canaux Ca2+ du récepteur à la ryanodine (RyR) dans un locus périnucléaire, tel que déterminé par les patrons de fluorescence de BODIPY® FL thapsigargine et de BODIPY® FL-X Ry. Lorsque les réserves de Ca2+ intracellulaire ont été mobilisées par l'addition de thapsigargine (5 mM) et de concentrations activatrices de ryanodine (1 mM), les signaux ratiométriques de l'Indo-1 ont été principalement limités au nucléoplasme. Les signaux cytosoliques, par comparaison, ont été relativement faibles et, même alors, leur répartition a été périnucléaire plutôt qu'homogène. Ces observations indiquent que les protéines SERCA et RyR périnucléaires sont étroitement liées à la régulation des concentrations de Ca2+ nucléoplasmique des CMLV. Nous avons aussi observé un profil de mobilisation du Ca2+ fortement nucléoplasmique après l'exposition des cellules à l'immunosuppresseur, FK506 (tacrolimus), qui se fixe aux protéines FKBP12 et FKBP12.6 liant l'immunophiline associée aux RyR. Toutefois, la mobilisation initiale du Ca2+ nucléoplasmique par FK506 a été suivie d'une réduction marquée de l'intensité du signal Indo-1 avoisinant les taux de prétraitement, ce qui a laissé supposer que FK506 a des effets à la fois activateurs et inhibiteurs sur les canaux RyR. Cette hypothèse a été renforcée lorsque FK506 a réduit l'intensité du signal seulement après un prétraitement avec des concentrations activatrices et inhibitrices de ryanodine. Ces observations soulèvent la possibilité que les noyaux des CMLV représentent une importante réserve de Ca2+ et pourraient aider à expliquer les actions vasodilatatrices de FK506 observées par d'autres chercheurs.Mots clés : Ca2+, RyR, SERCA, noyau cellulaire, FK506, thapsigargine, ryanodine.[Traduit par la Rédaction]
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Document Type: Research Article

Publication date: March 1, 2003

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