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Angiotensin II AT1 receptor internalization, translocation and de novo synthesis modulate cytosolic and nuclear calcium in human vascular smooth muscle cells

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The present study was designed to verify if human (h) Angiotensin II (Ang II) type-1 receptor (hAT1R) undergoes internalization, nuclear translocation, and de novo synthesis in primary culture of human aortic vascular smooth muscle cells (hVSMCs) and if overexpression of this receptor modulates sustained free cytosolic ([Ca]c) and nuclear ([Ca]n) calcium. 3-dimensional (3-D) confocal microscopy was used to monitor free intracellular Ca2+ and hAT1R-green fluorescence protein (GFP) fusion protein in cultured hVSMCs. Immunofluorescence studies showed the presence of hAT1R and the absence of hAT2R in normal hVSMCs. Using 3-D imaging technique, hAT1 receptors were localized at the sarcolemma and in the cytosolic and nuclear compartments. In native as well as in normal hAT1R or hAT1R –GFP overexpressing hVSMCs, Ang II (10–9 and 10–4 M) induced internalization and nuclear translocation of this type of receptor. The internalization of hAT1Rs is mediated via clathrin-coated pits and vesicles pathway. This phenomenon of trancellular trafficking of receptors was associated with an increase of hAT1R. The Ang II induced increase of hAT1R density was prevented by the protein synthesis inhibitor cycloheximide. Overexpression of hAT1R and hAT1R–GFP decreased both basal cytosolic and nuclear Ca2+. In normal hVSMCs and low hAT1R–GFP overexpressing hVSMCs, Ang II (10–15 to 10–4 M) induced a dose-dependent sustained increase of [Ca]c and [Ca]n with an EC50 near 5 × 10–11 and 5 × 10–9 M, respectively. Our results suggest that hAT1Rs are the predominant type of Ang II receptors in aortic hVSMCs and are present in the sarcolemma, the cytosolic and the nuclear compartments. Ang II rapidly induces hAT1R internalization, nuclear translocation, as well as nuclear de novo synthesis of this receptor. The hAT1R overexpression in hVSMCs modulates sustained [Ca]c and [Ca]n.Key words: angiotensin, calcium, protein synthesis, nucleus, AT1 receptor, nuclear de novo synthesis.

Le but de la présente étude était de vérifier si dans les cellules du muscle lisse vasculaire aortique (hVSMCs), le récepteur de l'angiotensine II (Ang II) de type 1 humain (hAT1R) subit une internalisation, une translocation nucléaire et une synthèse de novo et si sa surexpression module les niveaux soutenus du calcium libre cytosolique ([Ca]c) et nucléaire ([Ca]n). Nous avons utilisé la méthode de microscopie confocale en 3 dimensions (3-D) afin de mesurer le Ca2+ libre intracellulaire et la protéine de fusion hAT1R-protéine fluorescente verte (GFP) dans les hVSMCs en culture. Les études en immunofluorescence ont montré la présence de hAT1R dans les cellules hVSMCs normales et l'absence de hAT2R. La technique d'imagerie en 3-D a permis de démontrer la présence des récepteurs hAT1 au niveau de la sarcolemme ainsi que dans le cytosol et les compartiments nucléaires. Dans les hVSMCs exprimant normalement hAT1R ou surexprimant hAT1R ou hAT1R–GFP, l'Ang II (10–9 et 10–4 M) a induit l'internalisation et la translocation de ce type de récepteur. L'internalisation de hAT1R s'effectue par la voie des vésicules enrobées de clathrine. Ce phénomène de trafic transcellulaire a été associé à une augmentation de hAT1R. L'augmentation de la densité de hAT1R induite par l'Ang II a été bloquée par un inhibiteur de la synthèse protéique, le cycloheximide. La surexpression de hAT1R et de hAT1R–GFP a diminué les niveaux de calcium basal cytosolique et nucléaire. Dans les hVSMCs normales et celles surexprimant le hAT1R–GFP, l'Ang II (10–15 à 10–4 M) a induit de façon soutenue le [Ca]c et le [Ca]n avec respectivement une EC50 de 5 × 10–11 et 5 × 10–9 M. Nos résultats suggèrent que les hAT1Rs sont les types de récepteurs à l'Ang II les plus exprimés dans les hVSMCs et qu'ils sont présents au niveau de la sarcolemme, du cytosol et des compartiments nucléaires. L'Ang II induit rapidement l'internalisation, la translocation nucléaire ainsi que la synthèse nucléaire de novo de ce récepteur. La surexpression de hAT1R dans les hVSMCs module les niveaux soutenus de [Ca]c et de [Ca]n.Mots clés : angiotensine, calcium, synthèse protéique, noyau, récepteurs AT1, synthèse protéique de novo.
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Document Type: Research Article

Publication date: March 1, 2003

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