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Characterization of cyclic AMP-regulated chloride conductance in the pigmented rabbit conjunctival epithelial cells

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We have previously reported that the pigmented rabbit conjunctiva is a Cl secreting tissue, subject to cAMP, Ca2+, and PKC modulation. The present study was conducted to characterize, at the cellular and molecular levels, cAMP-regulated Cl channels in rabbit conjunctival epithelial cells. cAMP-inducible Cl channel properties were evaluated by monitoring the whole-cell currents using patch clamp techniques. Results showed that 10 µM forskolin significantly stimulated a glibenclamide-inhibitable whole-cell conductance by approximately five-fold. Furthermore, reduction of the Cl concentration in the bathing solution through partial substitution of NaCl with Na-isethionate resulted in a rightward shift of the reversal potential for both baseline and forskolin-stimulated whole-cell currents from 0 to values close to the theoretical Cl reversal potential predicted by the Nernst equation. Western blot analysis with a monoclonal antibody recognizing the epitope in the C-terminus of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) showed a positive band at its molecular weight, approximately 170 kD. Immunostaining under confocal microscopy revealed a CFTR specific signal in the apical sections of primary conjunctival epithelial cells. In addition, RT-PCR detection amplified a cDNA fragment 100% identical to the predicted portion of the cloned rabbit CFTR message. The stage is thus set for determining the extent of CFTR contribution to cAMP-regulated Cl conductance in pigmented rabbit conjunctival epithelial cells.Key words: conjunctiva, chloride current, CFTR, chloride channel, patch clamp, cyclic AMP, whole-cell.

Nous avons déjà signalé que la conjonctive pigmentée du lapin est un tissu sécrétant du Cl, sujet à modulation par l'AMPc, le Ca2+ et la PKC. La présente étude a eu pour but de caractériser, sur les plans cellulaire et moléculaire, les canaux Cl régulés par l'AMPc dans les cellules épithéliales conjonctivales du lapin. On a évalué les propriétés des canaux Cl inductibles par l'AMPc, en enregistrant les courants en cellule entière au moyen des techniques de patch clamp. Les résultats ont montré qu'une dose de 10 µM de forskoline a stimulé significativement, d'un facteur cinq environ, une conductance inhibable par le glibenclamide. De plus, la réduction de la concentration de Cl dans la solution, en remplaçant partiellement le NaCl par de l'iséthionate-Na, a provoqué un déplacement vers la droite du potentiel d'inversion des courants de base et des courants stimulés par la forskoline, de 0 à des valeurs proches du potentiel d'inversion théorique du Cl calculé par l'équation de Nernst. L'analyse par transfert de Western, avec un anticorps monoclonal reconnaissant l'épitope dans la partie C-terminale du régulateur de la perméabilité transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), a montré une bande positive à son poids moléculaire d'environ 170 kD. L'immunocoloration en microscopie confocale a révélé un signal spécifique du CFTR dans les coupes apicales de cellules épithéliales conjonctivales primaires. De plus, la détection par RT-PCR a amplifié un fragment d'ADNc en tout point identique au message du CFTR de lapin cloné. Tout les éléments sont en place pour déterminer la contribution du CFTR à la conductance Cl régulée par l'AMPc dans les cellules épithéliales conjonctivales pigmentées de lapin.Mots clés : courant chlore, CFTR, canal chlore, patch clamp, AMP cyclique, cellule entière.[Traduit par la Rédaction]
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Keywords: conjunctiva, chloride current, CFTR, chloride channel, patch clamp, cyclic AMP, whole-cell, courant chlore, CFTR, canal chlore, patch clamp, AMP cyclique, cellule entière

Document Type: Research Article

Publication date: June 1, 2002

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