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Hyposmotic activation of ICl,swell in rabbit nonpigmented ciliary epithelial cells involves increased ClC-3 trafficking to the plasma membrane

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In mammalian nonpigmented ciliary epithelial (NPE) cells, hyposmotic stimulation leading to cell swelling activates an outwardly rectifying Cl conductance (ICl,swell), which, in turn, results in regulatory volume decrease. The aim of this study was to determine whether increased trafficking of intracellular ClC-3 Cl channels to the plasma membrane could contribute to the ICl,swell following hyposmotic stimulation. Our results demonstrate that hyposmotic stimulation reversibly activates an outwardly rectifying Cl current that is inhibited by phorbol-12-dibutyrate and niflumic acid. Transfection with ClC-3 antisense, but not sense, oligonucleotides reduced ClC-3 expression as well as ICl,swell. Intracellular dialysis with 2 different ClC-3 antibodies abolished activation of ICl,swell. Immunofluorescence microscopy showed that hyposmotic stimulation increased ClC-3 immunoreactivity at the plasma membrane. To determine whether this increased expression of ClC-3 at the plasma membrane could be due to increased vesicular trafficking, we examined membrane dynamics with the fluorescent membrane dye FM1-43. Hyposmotic stimulation rapidly increased the rate of exocytosis, which, along with ICl,swell, was inhibited by the phosphoinositide-3-kinase inhibitor wortmannin and the microtubule disrupting agent, nocodazole. These findings suggest that ClC-3 channels contribute to ICl,swell following hyposmotic stimulation through increased trafficking of channels to the plasma membrane.Key words: ClC-3, NPE, cell swelling, membrane trafficking, ciliary body epithelium.

Chez les cellules épithéliales ciliées non pigmentées (NPE) de mammifères, une stimulation hyposmotique conduisant au gonflement cellulaire active une conductance chlorique à rectification sortante (« ICl, gonflement ») qui, à son tour, résulte en une diminution de volume régulatrice. Le but de cette étude était de déterminer si une augmentation du trafic des canaux ClC-3 Cl intracellulaires vers la membrane plasmique pouvait contribuer à la « ICl, gonflement » suite à une stimulation hyposmotique. Nos résultats démontrent que la stimulation hyposmotique active de façon réversible un courant chlorique à rectification sortante, inhibé par le phorbol 12-dibutyrate (PDBu) et l'acide niflumique. La transfection d'un oligonucléotide anti-sens de ClC-3, contrairement à un oligonucléotide sens, a réduit l'expression de ClC-3 ainsi que la « ICl, gonflementl ». La dialyse intracellulaire à l'aide de deux anticorps différents dirigés contre ClC-3 a aboli l'activation de la « ICl, gonflement ». Une observation en microscopie par immunofluorescence a montré que la stimulation hyposmotique augmentait l'immunoréactivité de ClC-3 à la membrane plasmique. Afin de déterminer si cette augmentation de l'expression ClC-3 à la membrane plasmique pouvait être due à une augmentation du trafic vésiculaire, nous avons examiné la dynamique membranaire à l'aide de la sonde fluorescente FMI-43. La stimulation hyposmotique a augmenté rapidement le taux d'exocytose qui, parallèlement avec la « ICl, gonflement », a été inhibé par la wortmanin, un inhibiteur de PI3K, et le nocodazole, un agent dissociant les microtubules. Ces résultats suggèrent que les canaux ClC-3 contribuent à la « ICl, gonflement » après stimulation hyposmotique via une augmentation du trafic des canaux vers la membrane plasmique.Mots clés : ClC-3, NPE, gonflement cellulaire, trafic membranaire, épithélium cilié.[Traduit par Rédaction]
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Document Type: Research Article

Publication date: December 1, 2004

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