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Purification of bovine cathepsin B: proteomic characterization of the different forms and production of specific antibodies

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Cathepsin B (EC 3.4.22.1) has been highly purified (14 225 fold) from bovine kidney by a rapid procedure that included the preparation of an enriched lysosomal extract, a selective fractionation with ammonium sulphate, size-exclusion chromatography, two cation-exchange chromatographies, and anion-exchange chromatography on diethylaminoethyl–Sephacel. After the last purification step, two hydrolytic peaks against Z-Phe-Arg-AMC were separated from each other, a minor peak corresponding to the cathepsin B single-chain form and a major one representing the double-chain form of cathepsin B. The single-chain form showed a molecular mass of 31 kDa on sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrphoresis (PAGE) under reducing conditions, whereas the heavy chain of the double-chain form appeared as a doublet with molecular masses of 23.4 and 25 kDa, respectively. The identity of the different cathepsin B isoforms and the quality of the final enzyme preparation were confirmed by using two types of antibodies, one against a synthetic peptide sequence and one against purified cathepsin B. The proteomic study confirmed the identity of the different SDS–PAGE protein bands as cathepsin B isoforms and allowed the comparison and study of some structural differences between them at the level of their primary structures.Key words: cathepsin B, bovine kidney, MALDI-TOF, cathepsin B isoforms, antibodies.

La cathepsine B (EC 3.4.22.1) a été hautement purifiée (14 225 fois) à partir du rein bovin à l'aide d'un protocole rapide comprenant la préparation d'un extrait enrichi en lysosomes, fractionnement de cet extrait par précipitation sélective au sulfate d'ammonium, une chromatographie d'exclusion moléculaire, deux chromatographies d'échange cationique et une chromatographie d'échange anionique. Après la dernière étape de purification, deux pics hydrolysant le substrat Z-Phe-Arg-AMC ont été séparés, le plus faible d'entre eux correspondant à la forme monochaîne et l'autre à la forme double chaîne de la cathepsine B. La forme monochaîne montre une masse moléculaire de 31 kDa en électrophorèse en gel d'acrylamide en conditions dénaturantes, tandis que la chaine lourde de la forme double chaîne apparaît sous forme d'un doublet de masses moléculaires 23,4 et 25 kDa, respectivement. L'identité des différents isoformes de la cathepsine B et la qualité de la préparation finale de l'enzyme a été confirmé par l'emploi de deux types d'anticorps, l'un dirigé contre une séquence peptidique synthétique et l'autre dirigé contre la cathepsine B purifiée. L'étude protéomique a confirmé l'identité des différentes bandes protéiques séparées en électrophorèse comme étant bien des isoformes de la cathepsine B, permettant également la comparaison et l'étude de quelques différences entre elles au niveau de leurs structures primaires.Mots clés : cathepsine B, rein de bovin, MALDI-TOF, isoformes de la cathepsine B, anticorps.
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Document Type: Research Article

Publication date: August 1, 2003

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