Minimal promoter for the NAD⁺-specific glutamate dehydrogenase gene of Neurospora crassa

The expression of the NAD⁺-specific glutamate dehydrogenase (NAD-GDH) gene of Neurospora crassa is subject to catabolite repression. To identify the minimal sequence necessary for promoter function, the 5'-flanking region of the NAD-GDH gene was screened for potential protein-binding sites. Fragments of DNA, containing sequences upstream from the ATG initiation codon, were employed as probes of Southwestern blots of total cellular protein from cells grown in media promoting repression and induction of NAD-GDH. Two polypeptides interacted differentially with a promoter probe; one was present in greater abundance in repressed cells and a higher relative level of the second was witnessed in induced cells. Electrophoretic mobility shift assays with labeled promoter fragments exhibited preferential interaction with proteins in the induced cultures. The upstream sequence containing the putative protein-binding sites was fused with the coding sequence of the green fluorescent protein (GFP). The resulting plasmid was introduced into the microconidia of an albino mutant of N. crassa by electroporation. Stable integration of the plasmid and expression of GFP in the hyphae and conidia of the transformants were demonstrated by Southern and Western blot analysis and fluorescence microscopy.Key words: Neurospora crassa, repression, induction, GFP fusion, electroporation, microconidia.

L'expression du gène de la glutamate déshydrogénase spécifique du NAD⁺ (GDH-NAD) de Neurospora crassa peut être réprimée par un catabolite. Afin d'identifier la séquence minimale nécessaire à la fonction du promoteur, des sites potentiels de liaison de protéines ont été recherchés dans la région flanquante 5' du gène de la GDH-NAD. Des fragments d'ADN comportant des séquences en amont du codon d'initiation ATG ont été utilisés comme sondes lors de transferts Southwestern de protéines cellulaires totales provenant de cellules cultivées dans des milieux entraînant la répression ou l'induction du gène de la GDH-NAD. Deux polypeptides interagissent différemment avec une sonde du promoteur : un de ces polypeptides est plus abondant dans les cellules réprimées et il y a un taux plus élevé du second polypeptide dans les cellules induites. Des tests de modification de la mobilité électrophorétique utilisant des fragments marqués du promoteur montrent qu'ils interagissent préférentiellement avec des protéines se trouvant dans les cellules induites. La séquence en amont comportant les sites potentiels de liaison des protéines a été fusionnée à la séquence codante de la protéine de fluorescence verte (GFP). Ce plasmide a été introduit par électroporation dans les microconidies d'un mutant albinos de N. crassa. Une intégration stable du plasmide et l'expression de la GFP dans les hyphes et les conidies des transformants ont été démontrées par transferts Southern et Western et par microscopie en fluorescence.Mots clés : Neurospora crassa, répression, induction, fusion à la GFP, électroporation, microconidies.[Traduit par la Rédaction]