Dimerization of the RelA protein of Escherichia coli

The RelA protein of Escherichia coli is a ribosome-associated (p)ppGpp synthetase that is activated by amino acid deprivation. It was recently reported that the activity of RelA is regulated by oligomerization mediated by the C-terminal domain of RelA. The oligomerization of RelA is further characterized in this study. The C-terminal domain consisting of amino acids 455–744, designated 'RelA, formed homooligomers as well as heterooligomers with RelA as demonstrated by copurification of RelA and 'RelA and by an affinity blotting assay. Glutaraldehyde-induced cross-linking indicated that the oligomer was a dimer. The functional analysis of 'RelA was based on a combination of yeast two-hybrid analysis, the determination of the effects of overexpression of 'RelA derivatives on the stringent response, and the cellular localization of the overexpressed 'RelA derivatives. These studies indicated that two regions, designated 'RelA-1 (amino acids 455–538) and 'RelA-2 (amino acids 550–682), were involved in dimerization. The involvement of one of these two regions, RelA-2, is consistent with a previous site-directed mutagenesis study. In addition to dimerization, 'RelA-2 apparently contained the main ribosome-binding domain of RelA. The third region, 'RelA-3 (amino acids 682–744), was not involved in either dimerization or ribosome binding. The overexpression of 'RelA-1 and 'RelA-2, but not 'RelA-3, inhibited the stringent response. These results support the previously proposed model which suggests a role for oligomerization in the regulation of (p)ppGpp synthetase.Key words: RelA, Escherichia coli, stringent response.

La protéine RelA de Escherichia coli est une (p)ppGpp synthétase associée aux ribosomes qui est activée lors d'une carence en acides aminés. Il a été rapporté récemment que l'activité de RelA est réglée par une oligomérisation s'effectuant par l'intermédiaire du domaine C-terminal de RelA. Dans cet article, nous poursuivons la caractérisation de l'oligomérisation de RelA. Le domaine C-terminal, nommé 'RelA et constitué des acides aminés 455 à 744, forme des homo-oligomères et des hétéro-oligomères avec RelA, comme le montre la copurification de RelA et de 'RelA, ainsi qu'un test de buvardage d'affinité. La réticulation à l'aide du glutaraldéhyde montre que l'oligomère est un dimère. La fonction de 'RelA à été étudiée en utilisant un système dihybride de levure, en déterminant les effets d'une surexpression de dérivés de 'RelA sur la réponse stringente et en localisant les dérivés 'RelA surexprimés dans les cellules. Ces études montrent que deux régions, dénommées 'RelA-1 (acides aminés 455 à 538) et 'RelA-2 (acides aminés 550 à 682), interviennent dans la dimérisation. La participation d'une de ces deux régions, 'RelA-2, est en accord avec une étude précédente de mutagenèse dirigée. En plus de son rôle dans la dimérisation, 'RelA-2 contiendrait le principal domaine de liaison au ribosome de RelA. La troisième région, 'RelA-3 (acides aminés 682 à 744), n'intervient pas dans la dimérisation ni dans la liaison au ribosome. La surexpression de 'RelA-1 et 'RelA-2 inhibe la réponse stringente, mais non celle de 'RelA-3. Ces résultats sont en accord avec le modèle proposé précédemment suggérant que l'oligomérisation joue un rôle dans la régulation de la (p)ppGpp synthétase.Mots clés : RelA, Escherichia coli, réponse stringente.[Traduit par la Rédaction]