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Free Content Identification of Old World Leishmania species by PCR–RFLP of the 7 spliced leader RNA gene and reverse dot blot assay

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Summary The aim of the study was to assess the 7SL RNA PCR followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and reverse dot blot (RDB) assays for use in identification of Old World species. Species-specific RFLP patterns were obtained for , and the when the 7SL RNA PCR product was digested with the restriction enzyme , an isoschizomer of . For the RDB assay, biotin-labelled 7SL RNA amplicons were hybridized to genus-specific and species-specific oligonucleotide probes immobilized onto a membrane The Old World species could be distinguished by using five probes: one that was a genus-specific probe and hybridized to all species (Lc), two that were specific for (Lm1 and Lm2), one that was specific for (Lt) and one that detected both and (Lmt). The PCR–RDB was 10 times more sensitive than 7SL PCR and can detect <1 parasite. In addition, the identification of species was easier and more reliable than with 7SL PCR–RFLP. 7SL PCR–RFLP detected parasites in 50 of 57 clinical samples, whereas PCR–RDB detected 53 and 55 were detected by amplification of kinetoplast (k) DNA. The 7SL RNA PCR has proven useful for direct diagnosis of Old World leishmaniasis, especially when combined with the RBD assay for species identification.

Le but de cette étude était d’évaluer des tests de PCR de l’ARN 7SL suivie du polymorphisme de la taille des fragments de restriction (RFLP) et du Dot Blot inversé (RDB) dans l’identification des espèces de Leishmania du Vieux Monde. Des profils RFLP spécifiques aux espèces ont été obtenus pour L. majeurs, L. tropica et L. donovani complex lorsque le produit PCR de l’ARN 7SL est digéré par l’enzyme de restriction BsuRI, un isoschizomer de HaeIII. Pour le test RDB, des amplicons d’ARN 7SL marqués à la biotine ont été hybridés avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques du genre et d’espèces Leishmania, immobilisées sur une membrane. Les espèces Leishmania du Vieux Monde pouvaient être distinguées sur base de cinq sondes: une sonde spécifique du genre et hybridant avec toutes les espèces de Leishmania (Lc), deux sondes spécifiques àL. major (Lm1 et Lm2), une spécifique àL. Tropica (Lt) et une détectant à la fois L. major et L. Tropica (Lmt). La PCR-RDB était 10 fois plus sensible que la PCR du 7SL et pouvait détecter <1 parasite. En outre, l’identification des espèces était plus facile et plus fiable qu’avec la PCR-RFLP du 7SL. La PCR-RFLP du 7SL a détecté des parasites dans 50 des 57 échantillons cliniques, alors que la PCR-RDB en a détecté 53 et 55 ont été détectés par l’amplification de kinétoplaste (k) de l’ADN. La PCR de l’ARN 7SL s’est avérée utile pour le diagnostic direct de leishmaniose de l’Ancien Monde, surtout lorsqu’elle est combinée avec le test RBD pour l’identification des espèces.
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Keywords: 7SL RNA gene; Leishmania de l’Ancien Monde; Leishmania del Viejo Mundo; Old World Leishmania; PCR –RFLP; PCR-RFLP; PCR–RFLP; RDB assay; gen 7SL ARN; gène de l’ARN 7SL; prueba dot blot reverso; test RDB

Document Type: Research Article

Affiliations: 1:  Al-Quds Nutrition and Health Research Institute, Faculty of Medicine, Al-Quds University, Abu-Deis, West Bank, Palestine 2:  Institute of Microbiology and Hygiene, Charité University Medicine Berlin, Dorotheenstr. 96, Berlin, Germany

Publication date: August 1, 2010

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