Role of protein kinase C β₂ activation in TNF-α-induced human vascular endothelial cell apoptosis

Authors: Wang, Fang; Liu, Hui-min; Irwin, Michael G.; Xia, Zhong-yuan; Huang, Zhiyong; Ouyang, Jingping; Xia, Zhengyuan

Source: Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, Volume 87, Number 3, March 2009 , pp. 221-229(9)

Publisher: NRC Research Press

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Abstract:

The circulatory inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNF-α) is increased in pathologic conditions that initiate or exacerbate vascular endothelial injury, such as diabetes. Protein kinase C (PKC) has been shown to play a critical role in TNF-α-induced human endothelial cell apoptosis. However, the relative roles played by specific isoforms of PKC in TNF-α-induced human endothelial cell apoptosis have not been addressed. We investigated the effects of a selective PKCβ₂ inhibitor (CGP53353) on TNF-α-induced apoptosis in human vascular endothelial cells (cell line ECV304) and on the production of reactive oxygen species and nitric oxide, and compared its effects with rottlerin, a reagent that has been shown to reduce PKCδ protein levels. Cultured human vascular endothelial cells (ECV304) were treated for 24 h with one of 4 regimes: 40 ng/mL TNF-α alone (TNF-α), TNF-α with 10 µmol/L rottlerin (T+rottlerin), TNF-α with 1 µmol/L CGP53353 (T+CGP), or untreated (control). Cell viability was measured by MTT assay, and cell apoptosis was assessed by flow cytometry. TNF-α-induced endothelial cell apoptosis was associated with dramatic increases in production of intracellular hydrogen peroxide (approximately 20 times greater than control) and superoxide (approximately 16 times greater than control), as measured by dichlorofluorescein and dihydroethidium fluorescent staining, respectively. This increase was accompanied by reduced activity of superoxide dismutase and glutathione peroxidase and, subsequently, an increase in the lipid peroxidation product malondialdehyde. CGP53353, but not rottlerin, abolished or attenuated all these changes. We conclude that PKCβ₂ plays a major role in TNF-α-induced human vascular endothelial cell apoptosis.

La cytokine inflammatoire facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) augmente dans les pathologies, telles que le diabète, qui déclenchent ou aggravent une lésion endothéliale vasculaire. Des études ont montré que la protéine kinase C (PKC) joue un rôle important dans l'apoptose des cellules endothéliales humaines induite par le TNF-α. Toutefois, les rôles relatifs joués par une isoforme spécifique de la PKC dans l'apoptose des cellules endothéliales induite par le TNF-α n'ont pas fait l'objet de travaux spécifiques. Nous avons examiné les effets d'un inhibiteur sélectif de la PKCβ₂ (CGP53353) sur l'apoptose induite par le TNF-α dans des cellules endothéliales vasculaires humaines (lignée cellulaire ECV304), ainsi que sur la production d'espèces réactives de l'oxygène et de monoxyde d'azote, et comparé les effets de cet inhibiteur avec ceux du rottlerin, un réactif qui diminue les taux de la protéine PKCδ. Nous avons utilisé des cellules endothéliales vasculaires humaines cultivées (ECV304) non traitées (témoins), ou traitées avec le TNF-α (40 ng/mL) seulement (TNF-α) ou avec le TNF-α en présence de 10 µmol/L de rottlerin (T+rottlerin) et de 1 µmol/L de CGP53353 (T+CGP), respectivement, pendant 24 h. Nous avons mesuré la viabilité cellulaire par une test au bromure de MTT, et évalué l'apoptose cellulaire par cytométrie de flux. L'apoptose des cellules endothéliales induite par le TNF-α a été associée à une augmentation significative de la production cellulaire de peroxyde d'hydrogène (environ 20 fois plus élevée que celle des témoins) ou de superoxyde (environ 16 fois plus forte que celle des témoins), comme mesuré par la fluorescence de la dichlorofluorescéine et du dihydroéthidium, respectivement. Cette augmentation a été accompagnée d'une réduction des activités de la superoxyde dismutase et de la glutathion peroxydase, puis d'une augmentation du produit de la peroxydation lipidique, malondialdéhyde. Le CGP53353, mais pas le rottlerin, a supprimé ou atténué toutes ces modifications. On conclut que la PKCβ₂ joue un rôle majeur dans l'apoptose des cellules endothéliales vasculaires humaines induite par le TNF-α.

Document Type: Research article

Publication date: 2009-03-01

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