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Apoptose radio-induite: une nouvelle approche par microspectroscopie infrarouge

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Purpose: to characterize radiation-induced apoptosis in human cells using Fourier transform infrared microspectroscopy (FT-IRM) as a new analytical tool. Material and methods: Normal human circulating lymphocytes were given a  ray dose of 6 Gy, or treated with t-butyl hydroperoxide (t-BuOH). HaCaT keratinocytes were given a dose of 20 Gy. Cells were deposited on ZnS windows for infrared spectral acquisition 2 days and 2 h after irradiation and 2 h after t-BuOH treatment. Apoptosis was simultaneously assessed by flow cytometry analysis of cells displaying annexin-V-positive staining. Results. The flow cytometry study showed that about 90% of sham and irradiated cells were annexin-V negative 2 h after irradiation. Two days after irradiation, 68% of lymphocytes and 76% of HaCaT cells were apoptotic, as well as 43% of lymphocytes treated with t-BuOH. In infrared spectra of these apoptotic cells, qualitative and quantitative changes were observed. In the 960–1245 and 1690–1720 cm–1 ranges, mainly attributed to nucleic acids, changes corresponding to conformational changes in DNA were associated with a decrease in the amount of detectable DNA. Conformational changes were also observed in secondary protein structure, in particular an increase in the amount of  structures. These DNA and protein changes were associated with an increase in the detectable amount of lipids in apoptotic HaCaT cells only. Two hours after irradiation, depending on the dose and (or) the cell type, qualitative and quantitative changes were observed in the IR spectra in the amide I and amide II bands, mainly attributed to proteins. These changes were associated with a significant decrease in the 1700–1750 cm–1 range, mainly attributed to the –C=O ester groups of DNA and phospholipids, in the irradiated HaCaT cells only. Conclusion: Our results are in agreement with biochemical published data on radiation-induced apoptosis, and show that DNA is the first cellular target of radiation-induced apoptosis, which, however, also requires conformational changes and synthesis of cell proteins. They also demonstrate that FT-IRM may be useful for assessing the early radiation damage at the molecular level in human cells.Key words: apoptosis, Fourier transform infrared microspectroscopy,  irradiation, human lymphocytes, HaCaT keratinocytes.

Objectif : Caractériser les altérations biochimiques intracellulaires de l'apoptose radio-induite dans des cellules humaines, par microspectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IRM). Matériel et méthodes : Des lymphocytes humains circulants ont été irradiés in vitro à 6 Gy  ou traités au t-butyl hydroperoxide (t-BuOH), et des kératinocytes HaCaT ont été irradiés à 20 Gy. Les cellules ont été déposées sur des lames de ZnS pour l'acquisition des spectres infrarouge, 2 jours et 2 h après irradiation, et 2 h après traitement au t-BuOH. Les cellules apoptotiques ont été quantifiées par marquage à l'annexine-V en cytométrie de flux. Résultats : Deux heures après irradiation, l'étude en cytométrie de flux a montré qu'environ 90 % des cellules témoins et irradiées étaient annexin-V négatives. Deux jours après irradiation, 68 % des lymphocytes et 76 % des cellules HaCaT étaient en apoptose, ainsi que 43 % des lymphocytes 2 h après traitement au t-BuOH. Dans les spectres de lymphocytes et de cellules HaCaT apoptotiques, plusieurs modifications qualitatives et quantitatives ont été observées. Dans les bandes 960–1245 et 1690–1720 cm–1, principalement attribuées aux acides nucléiques, des modifications de spectres correspondant à des changements de conformation de l'ADN étaient associées à une diminution du taux détectable d'ADN. Des changements de conformation ont été également observés dans la structure secondaire des protéines, en particulier une augmentation des structures en feuillets beta. Ces modifications de structure de l'ADN et des protéines étaient associées à une augmentation du taux de phospholipides détectables, observée uniquement dans les cellules HaCaT en apoptose. Deux heures après irradiation, des modifications qualitatives et quantitatives étaient observées dans les spectres infrarouge, en fonction de la dose et (ou) du type cellulaire, dans les bandes amide I et II, principalement attribuées aux protéines. Ces modifications de spectres étaient associées, dans les cellules HaCaT irradiées uniquement, à une diminution significative de la bande 1700–1750 cm–1, principalement attribuée aux groupements –C=O esters de l'ADN et des phospholipides. Conclusion : Les résultats de cette étude sont en accord avec les données biochimiques publiées sur l'apoptose radio-induite, et montrent que l'ADN est la première cible cellulaire du processus apoptotique, néanmoins associé à des modifications de conformation et à une synthèse de protéines. Ces résultats montrent également que la FT-IRM peut être une méthode de choix pour l'étude des effets précoces de l'irradiation dans des cellules humaines à l'échelle moléculaire.Mots clés : apoptose, microspectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, irradiation , lymphocytes humains, kératinocytes HaCaT.
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Document Type: Research Article

Publication date: 2004-01-01

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  • Published since 1929, this monthly journal reports current research in all aspects of physiology, nutrition, pharmacology, and toxicology, contributed by recognized experts and scientists. It publishes symposium reviews and award lectures and occasionally dedicates entire issues or portions of issues to subjects of special interest to its international readership.
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