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Evaluation of a new fluorimetric DNA-DNA hybridization method

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Abstract:

Standardized procedures must be followed when characterizing, officially describing, and validly naming novel bacteria. For species descriptions, DNA-DNA hybridization still is needed for whole-genome comparisons between close relatives, but many established hybridization methods have drawbacks, such as requiring labeled or large amounts of DNA. We evaluated a new technique based on the spectrophotometric method in which renaturation rates are used for calculating the degree of binding, which estimates relatedness. In this new approach, DNA is denatured and reassociated in a real-time PCR thermal cycler and the process monitored fluorimetrically using SYBR Green I dye that selectively binds to double-stranded DNA. We investigated the effects of different parameters on the renaturation rates, such as the quantities of DNA and SYBR Green I used. Then using this technique, we calculated the percent binding for pairs of selected bacterial species representing different taxonomic groups and compared our results with published values. We demonstrated that the SYBR Green I method is useful for describing new species and as a screening tool to quickly identify the relatedness of uncharacterized isolates with similar 16S rRNA gene sequences.

Des procédures standardisées doivent être suivies lorsqu’une nouvelle bactérie est caractérisée, décrite officiellement et nommée validement. Lors de la description d’une espèce, l’hybridation ADN-ADN est encore requise pour comparer à l’échelle du génome de proches parents, mais plusieurs méthodes d’hybridation établies possèdent des inconvénients tels que requérir de l’ADN soit marqué, soit en grande quantité. Nous avons évalué une nouvelle technique reposant sur une méthode spectrophotométrique dans laquelle les taux de renaturation sont utilisés afin de calculer le degré de liaison qui estime le degré de parenté. Avec cette nouvelle approche, l’ADN est dénaturé et réassocié en temps réel dans un thermocycleur PCR, et le processus est suivi en fluorométrie à l’aide du colorant SYBR Green I qui se lie sélectivement à l’ADN double brin. Nous avons étudié les effets de différents paramètres sur les taux de renaturation, notamment les quantités d’ADN et de SYBR Green I utilisées. Ainsi, à l’aide de cette technique, nous avons calculé le pourcentage de liaison entre des paires d’espèces bactériennes sélectionnées pour représenter différents groupes taxonomiques, et nous avons comparé nos résultats avec les valeurs publiées. Nous avons démontré que la méthode au SYBR Green I est utile pour décrire de nouvelles espèces et pour dépister rapidement le degré de parenté entre des isolats nouveaux possédant des séquences géniques d’ARNr 16S similaires.

Document Type: Research Article

Publication date: 2011-03-01

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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