Analysis of high-level S-layer protein secretion in Caulobacter crescentus

$50.00 plus tax (Refund Policy)

Buy Article:

Abstract:

Caulobacter crescentus exhibits a hexagonally arranged protein layer on its outermost surface. RsaA, the sole protein of this “S-layer”, is secreted by a type I (ABC) transporter. Few type I transporters show high-level secretion, and few bacterial S-layers have been carefully examined for the amount of protein synthesis capacity needed to maintain cell coverage. Here we determined RsaA levels by quantitative immunoblotting methods, learned that very stable mRNA is a key factor in high-level secretion, and found that the transporter was capable of still higher secretion. A propensity for RsaA to aggregate was a barrier to quantitation, but with the use of S-layer shedding mutants and methods to keep RsaA soluble, we learned that ~31% of cell protein is RsaA. When multiple copies of rsaA were introduced, the level increased to ~51% of cell protein, a higher level than we are aware of for any protein in any bacterium. Unexpectedly, in comparing normal and S-layer shedding strains, an assembled S-layer was not a significant barrier to elevated secretion. The rsaA mRNA half-life was determined by real-time PCR to be 36 min, ranking with the most stable known in bacteria. A modification of the 5′ region resulted in a shorter half-life and a reduction in maximum protein synthesis levels. If secretion was prevented by knockout of type I transporter genes, RsaA levels dropped to 10% or less of normal, but with no significant reduction in rsaA mRNA. Overall, normal levels of RsaA were unexpectedly high, and still higher levels were not limited by transporter capability, the presence of an assembled S-layer, or the capacity of the cell’s physiology to produce large amounts of one protein. The normal upper limit of RsaA production appears to be controlled only by the level of an unusually stable message. Significant down-regulation is possible and is accomplished posttranscriptionally.

Caulobacter crescentus possède une couche de protéines arrangées de manière hexagonale à sa surface la plus externe. RsaA, la seule protéine de cette « couche-S », est secrétée par un transporteur ABC de type I. Le taux de sécrétion des transporteurs de type I n’est généralement pas élevé et peu de couches-S bactériennes ont été soigneusement examinées jusqu’à présent, relativement au niveau de synthèse protéique requis pour maintenir la cellule recouverte. Les niveaux de RsaA ont été déterminés par un immunobuvardage quantitatif et nous avons appris qu’une très grande stabilité de l’ARNm est un facteur clé dans un haut niveau de sécrétion, et nous avons trouvé que le transporteur est même capable d’une activité sécrétoire encore plus élevée. La propension de RsaA à s’agglomérer constituait un obstacle à sa quantification, mais l’utilisation de mutants de libération de la couche-S et de méthodes permettant de garder RsaA soluble nous ont permis d’apprendre qu’environ 31 % du contenu en protéine est constitué de RsaA. Lorsque de multiples copies de rsaA ont été introduites, le niveau de cette protéine a augmenté à environ 51 %, un niveau plus élevé que ce que nous connaissions pour toute protéine bactérienne. Étonnamment, en comparant les souches normales et mutantes, l’assemblage de la couche-S ne constituait pas un obstacle significatif à un niveau élevé de sécrétion. La demi-vie de l’ARNm rsaA déterminée par qPCR était de 36 min, se classant parmi les plus stables chez les bactéries. Une modification de la région en 5′ a résulté en une demi-vie plus courte et en une réduction des niveaux maximaux de synthèse protéique. Si la sécrétion était inhibée par l’ablation des gènes des transporteurs de type I, les niveaux de RsaA chutaient à 10 % ou moins de la normale, mais sans réduction de la quantité d’ARNm rsaA. En somme, les niveaux normaux de RsaA sont étonnamment élevés et des niveaux encore plus élevés ne sont pas limités par la capacité du transporteur, la présence d’une couche-S assemblée ou par la capacité de la cellule à produire une grande quantité d’une protéine donnée. La limite supérieure normale de production de RsaA semble contrôlée uniquement par le niveaux d’un messager inhabituellement stable. Une diminution est possible et elle est accomplie de façon post-transcriptionnelle.

Document Type: Research Article

Publication date: June 1, 2010

More about this publication?
  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
  • Information for Authors
  • Submit a Paper
  • Subscribe to this Title
  • Terms & Conditions
  • Sample Issue
  • Reprints & Permissions
  • ingentaconnect is not responsible for the content or availability of external websites
Related content

Tools

Favourites

Share Content

Access Key

Free Content
Free content
New Content
New content
Open Access Content
Open access content
Subscribed Content
Subscribed content
Free Trial Content
Free trial content
Cookie Policy
X
Cookie Policy
ingentaconnect website makes use of cookies so as to keep track of data that you have filled in. I am Happy with this Find out more