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Molecular and biochemical characterization of Iranian surfactin-producing Bacillus subtilis isolates and evaluation of their biocontrol potential against Aspergillus flavus and Colletotrichum gloeosporioides

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Abstract:

The characterization of surfactin-producing Bacillus subtilis isolates collected from different ecological zones of Iran is presented. Characterization was performed using blood agar, PCR, drop-collapse, and reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) analyses, and the isolates’ biocontrol effects against the aflatoxin-producing agent Aspergillus flavus and the citrus antracnosis agent Colletotrichum gloeosporioides were studied. In total, 290 B. subtilis isolates were isolated from phylosphere and rhizosphere samples collected from fields and gardens of 5 provinces of Iran. Blood agar assays showed that 185 isolates produced different biosurfactants. Isolates containing the sfp gene, coding for surfactin, were detected using the PCR method. It was found that 14 different isolates contained the sfp gene. Drop-collapse assays, which detect isolates with high production of surfactin, showed that 7 isolates produced high levels of surfactin. It was found from HPLC analysis that the isolates containin the sfp gene produced between 55 and 1610 mg of surfactin per litre of broth medium. Four isolates, named BS119m, BS116l, N3dn, and BS113c, produced more than 1000 mg of surfactin per litre of broth. The highest surfactin production level was observed for isolate BS119m (1610 mg/L). The antagonistic potential of the sfp gene-containing isolates was determined using dual culture and chloroform vapour methods. Our bioassay results indicated that isolate BS119m showed high inhibitory effects against A. flavus (100%) and C. gloeosporioides (88%). Furthermore, the effect of purified surfactin on the growth of A. flavus was evaluated. Mycelia growth was considerably reduced with increasing concentration of surfactin, and 36%, 54%, 84%, and 100% inhibitions of mycelia growth were, respectively, observed at 20, 40, 80, and 160 mg/L after 7 days of incubation.

Des isolats de Bacillus subtilis producteurs de surfactine et recueillis de différentes zones écologiques de l’Iran ont été caractérisés. La caractérisation des isolats a été réalisée sur gélose au sang, par PCR, par collapsus de gouttelettes (« drop collapse ») ainsi que par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (HPLC), et leurs effets biologiques dans le contrôle d’Aspergillus flavus, un agent producteur d’aflatoxine, et de Colletotrichum gloeosporioides, l’agent responsable de l’antracnose des agrumes, ont été étudiés. Un total de 290 isolats de B. subtilis ont été recueillis d’échantillons de la phyllosphère et de la rhizosphère de champs et de jardins de 5 provinces d’Iran. Les essais sur gélose au sang ont démontré que 185 isolats produisaient différents surfactants. Les isolats possédant le gène sfp qui code la surfactine ont été détectés par PCR. Quatorze isolats différents possédaient le gène sfp. Les essais de collapsus de gouttelettes qui permettent de détecter les isolats forts producteurs de surfactine ont démontré que 7 isolats produisaient de hauts niveaux de surfactine. Les analyses en HPLC des isolats possédant le gène sfp ont démontré qu’ils produisaient de 55 à 1610 mg de surfactine par litre de milieu de culture. Quatre isolats, BS119m, BS116l, N3dn et BS113c, produisaient plus de 1000 mg de surfactine par litre de milieu de culture. La production la plus élevée, soit 1610 mg/L, a été obtenue avec l’isolat BS119m. Le potentiel antagoniste des isolats comportant le gène sfp a été mesuré par les méthodes de double culture et de vapeur de chloroforme. Les résultats de nos essais biologiques indiquaient que l’isolat BS119m manifestait de forts effets inhibiteurs envers A. flavus (100 %) et C. gloeosporioides (88 %). De plus, l’effet de la surfactine purifiée sur la croissance de A. flavus a été évalué. La croissance du mycélium a été considérablement réduite par des concentrations croissantes de surfactine, et 36 %, 54 %, 84 % et 100 % d’inhibition de la croissance du mycélium ont été observées avec 20, 40, 80 et 160 mg/L de surfactine, respectivement, après 7 jours d’incubation.

Document Type: Research Article

Publication date: April 1, 2009

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