In vivo associations of Escherichia coli NarJ with a peptide of the first 50 residues of nitrate reductase catalytic subunit NarG

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Abstract:

The catalytic subunit of many Escherichia coli redox enzymes bares a twin-arginine translocation (Tat)-dependent signal peptide in its precursor, which directs the redox enzyme complex to this Sec-independent pathway. NarG of the E. coli nitrate reductase NarGHI complex possesses a vestige twin-arginine motif at its N terminus. During the cofactor insertion, and assembly and folding of the NarG-NarH complex, a chaperone protein, NarJ, is thought to interact with the N terminus and an unknown second site of NarG. Our previous in vitro study provided evidence that NarJ’s role shows some Tat system dependence. In this work, we investigated the associations of NarJ with a peptide of the first 50 residues of NarG (NarG50) in living cells. Two approaches were used: the Förster resonance energy transfer (FRET) based on yellow fluorescent protein - cyan fluorescent protein (YFP-CFP) and the bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Compared with the wild-type (WT) E. coli cotransformants expressing both NarJ-YFP and NarG50-CFP, tat gene mutants gave an apparent FRET efficiency (Eapp) that was on the order of 25%-40% lower. These experiments implied a Tat system dependency of the in vivo associations between NarJ and the NarG50 peptide. In the BiFC assay, a 4-fold lower specific fluorescence intensity was observed for the E. coli WT cotransformants expressing both NarJ-Yc and NarG50-Yn than for its tat mutants, again suggesting a Tat dependence of the interactions. Fluorescence microscopy showed a “dot”/unipolar distribution of the reassembled YFP-NarJ:NarG50 both in WT and tat mutants, demonstrating a distinct localization of the interaction. Thus, although the degree of the interaction shows Tat dependence, the cell localization is less so. Taken together, these data further support that NarJ’s activity on NarG may be assisted by the Tat system.

Les précurseurs de la sous-unité catalytique de plusieurs enzymes d’oxydoréduction d’Escherichia coli contiennent un peptide signal de translocation à motif dit « twin-arginine » (Tat) qui envoient le complexe enzymatique d’oxydoréduction vers cette voie indépendante de Sec. La sous-unité NarG de la nitrate réductase NarGHI de E. coli contient un vestige du motif « twin-arginine » à son extrémité N-terminale. Lors de l’insertion du cofacteur, de l’assemblage et du repliement du complexe NarG-NarH, on croit que la protéine chaperon NarJ interagit avec l’extrémité N-terminale et avec un deuxième site inconnu de NarG. Une étude antérieure réalisée in vitro a prouvé que NarJ faisait preuve d’une certaine dépendance envers le système Tat. Dans ce travail, nous avons examiné les associations de NarJ avec un peptide comportant les 50 premiers résidus de NarG (NarG50) dans les cellules vivantes. Deux approches ont été utilisées, le FRET (« Förster resonnance energy transfer ») entre YFP et CFP et la BiFC (« bimolecular fluorescence complementation »). Comparativement aux co-transformants d’E. coli sauvage exprimant NarJ-YFP et NarG50-CFP, les coefficients d’efficacité de FRET apparents (Eapp) des mutants du gène tat étaient de l’ordre de 25 % - 40 % plus faibles. Ces expériences impliquaient que les associations entre NarJ et le peptide NarG50 dépendaient du système Tat. Lors de l’essai BiFC, une intensité de fluorescence quatre fois plus faible a été observée chez les co-transformants de E. coli sauvage exprimant NarJ-Yc et NarG50-Yn comparativement aux mutants tat, suggérant encore que ces interactions dépendaient de Tat. La microscopie à fluorescence a révélé une distribution ponctuée / unipolaire de YFP-NarJ : NarG50 réassemblées chez les cellules sauvages et les mutants, démontrant que cette interaction était distinctement localisée. Ainsi, alors que le degré d’interaction est dépendant de Tat, la localisation cellulaire du complexe l’est moins. En somme, ces résultats apportent un appui supplémentaire à l’effet que l’activité de NarJ sur NarG puisse être aidée par le système Tat.

Document Type: Research Article

Publication date: February 1, 2009

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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