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Plasmid transformation and expression of the firefly luciferase in Microbacterium testaceum type and endophytic colonizing field strains

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Abstract:

Microbacterium testaceum is a predominant endophytic bacterial species isolated from corn and sorghum in the midwestern United States. The development of genetic transfer systems for M. testaceum may enable its use for biocontrol and other applications. The type strain (IFO 12675) and field isolates (SE017, SE034, and CE648) were grown to mid-exponential phase, concentrated (1.0 × 1011 CFU·mL-1), electroporated (Escherichia coli - Clavibacter shuttle plasmid pDM302), and plated on TSA with 10 µg·mL-1 chloramphenicol. Transformation efficiencies averaged 140 CFU·µg-1 of DNA. Restriction endonuclease analysis showed that pDM302 was not altered after extraction from transformants and re-introduction into E. coli. Transformants with pDM302 were also subjected to nonselective growth conditions, with the frequency of loss after one passage being 84% for IFO 12675 and 88% for SE034. We inserted the green fluorescent protein and the firefly luciferase (FFlux) reporter genes into pDM302, confirming the expression of FFlux in IFO 12675 and SE034. The SE034 FFlux strain was recovered from inoculated corn in greenhouse studies and found to fluoresce by luminometry. These results in M. testaceum demonstrate for the first time its transformability, pDM302 replication, FFlux gene expression, and the recovery of the FFlux recombinant strain from inoculated corn.

Microbacterium testaceum est une espèce bactérienne endophyte prédominante isolée du maïs et du sorgho dans le midwest des États-Unis. Le développement de systèmes de transfert génétiques chez M. testaceum pourrait permettre de l’utiliser comme agent de contrôle biologique ou pour d’autres fins. La souche type (IFO 12675) et les isolats de terrain (SE017, SE034, CE648) ont été cultivés jusqu’à la phase mi-exponentielle, concentrés (1,0 × 1011 UFC·mL-1), soumis à l’électroporation (avec le plasmide navette pDM302 Escherichia coli - Clavibacter) et ensemencés sur TSA contenant 10 µg·mL-1 chloramphénicol. Les efficacités de transformation se situaient en moyenne à 140 UFC·g-1. Une analyse de restriction a révélé que pDM302 n’était pas modifié après son extraction des transformants et sa réintroduction chez E. coli. Les transformants comportant pDM302 ont aussi été soumis à des conditions de croissance non-sélectives, la fréquence de perte après un passage étant de 84 % chez IFO 12675 et 88 % chez SE034. Nous avons inséré des gènes rapporteurs codant la protéine verte fluorescente et la luciférase de la luciole dans pDM302 et confirmé l’expression de la luciférase chez IFO 12675 et SE034. La souche SE034-luciférase récupérée de maïs inoculé lors d’études en serres s’est révélée fluorescente en luminométrie. Ces résultats chez M. testaceum démontrent pour la première fois sa capacité de transformation, la potentiel de réplication de pDM302, l’expression du gène de la luciférase et la récupération de la souche recombinante luminescente de maïs inoculé.

Document Type: Research Article

Publication date: November 1, 2008

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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nrc/cjm/2008/00000054/00000011/art00009
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