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Comparison of trichloroacetic acid with other protein-precipitating agents in enriching abnormal prion protein for Western blot analysis

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Abstract:

Detection of the abnormal or the pathogenic form of prion protein (PrPSc) by Western blot (WB) is challenging, especially, for samples derived from cell cultures that contain low levels of PrPSc. A variety of PrPSc concentration methods have been reported with various PrPSc recovery efficiencies. Ultracentrifugation is one of the methods used frequently to enrich the pathogenic form of PrPSc prior to WB analyses. The resulting PrPSc pellet is extremely insoluble and often requires sonication to be dissolved, potentially generating aerosols. We modified the common protein-precipitating protocol using trichloroacetic acid to concentrate PrPSc by slow-speed centrifugation, followed by solubilization of the pellets with 6 mol/L urea prior to sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis and WB analyses. Comparative studies suggest this simple trichloroacetic acid protocol was more effective in enriching PrPSc presented in cell cultures and brain homogenates than other reported protein-precipitating methods. Furthermore, incorporation of the urea treatment step to dissolve the precipitated PrPSc pellets helped to reduce the infectivity of PrPSc.

La détection de la protéine du prion dans sa forme pathogenique (PrPSc) ou anormale par buvardage Western est particulièrement difficile dans les cultures cellulaires à cause des faibles concentrations de PrPSc. Une variété de méthodes sont utilisées pour concentrer PrPSc mais celles-ci démontrent différentes efficacités de récupération. L’ultracentrifugation est une des méthodes qui est souvent utilisée avant le procédé de buvardage Western. Mais, le culot de PrPSc obtenu est souvent difficile à solubilizer et requiert l’utilisation de sonification, une méthode qui pourrait générer des aérosols. Nous avons modifié la méthode communément utilisée comme procédure de précipitation en utilisant de l’acide trichloroacétique pour concentrer PrPSc par centrifugation à basse-vitesse suivi par solubilization des culots obtenus avec de l’urée 6 mol/L avant l’analyse par l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécyl sulphate de sodium et buvardage Western. Cette étude comparative suggère que la méthode de précipitation au de l’acide trichloroacétique est plus efficace pour précipiter PrPSc dans des cultures cellulaires ainsi que dans des homogénats de cerveaux que d’autres méthodes couramment utilisées. De plus, l’incorporation de l’urée 6 mol/L dans notre méthode pour dissoudre le culot obtenu aide à réduire l’infectivité de PrPSc.

Document Type: Research Article

Publication date: June 1, 2008

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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