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Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection of Brucella DNA in peripheral human blood

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Abstract:

Brucellosis is a widespread zoonosis. Currently the diagnosis of this zoonosis is based on microbiological and serological laboratory tests. Polymerase chain reaction (PCR) has been used to detect DNA from Brucella. Different target genes, primer pairs, PCR techniques, and extraction procedures have previously been published for Brucella detection. But only a few of these primers have been used in human samples, and only one study has been carried out to compare sensitivity between them. In the present study, 3 sets of primers and 3 different PCR protocols amplifying 3 different regions of the Brucella genome were compared for detection of Brucella DNA in a peripheral-blood PCR assay to conclude which is most suitable for the clinical diagnostic laboratory. These 3 pairs of primers amplify 3 different fragments included in (i) a gene encoding a 31 kDa Brucella abortus antigen (B4/B5), (ii) a sequence 16S rRNA of B. abortus (F4/R2), and (iii) a gene encoding an outer membrane protein (omp-2) (JPF/JPR). Some modifications on the reported techniques were applied during the present work to improve the outcome. The results showed that the B4/B5 primer pair had the highest sensitivity for detection of positive samples (98%), the JPF/JPR primer pair detected 88.4% of positive samples, whereas F4/R2 primer pair was the least sensitive, being able to detect only 53.1% of positive samples. The specificity of the 3 techniques was 100%. The B4/B5 primer pair was also able to detect the smallest number of bacteria (700 cfu/mL), whereas JPF/JPR was able to detect 7 × 105 cfu/mL and F4/R2 was able to detect 7 × 107 cfu/mL. It is thus concluded that using the B4/B5 primer PCR with the suggested modifications is a robust assay, which meets the sensitivity requirements to be used for testing of human blood samples for brucellosis in the diagnostic laboratory.

La brucellose est une zoonose répandue. Le diagnostic actuel de cette zoonose est basé sur des tests de laboratoires microbiologiques et sérologiques. La PCR a été utilisée pour détecter l’ADN de Brucella. Différents gènes cibles, paires d’amorces, techniques en PCR et méthodes d’extraction utilisées pour la détection de Brucella ont été précédemment publiées. Mais seules quelques amorces ont été utilisées sur des échantillons humains et une seule étude a été réalisée pour comparer leur sensibilité. Dans cette étude, 3 séries d’amorces et 3 protocoles de PCR différents qui amplifient 3 régions différentes du génome de Brucella ont été comparés pour détecter l’ADN de Brucella dans le sang périphérique par essai de PCR afin de conclure lesquels étaient les plus adéquats à des fins de diagnostic clinique. Ces trois paires d’amorces amplifient trois fragments différents inclus dans : (i) un gène codant un antigène de 31 kDa de Brucella abortus (B4/B5), (ii) une séquence de l’ARNr 16S de B. abortus (F4/R2) et (iii) a gène codant une protéine de la membrane externe (omp-2) (JPF/JPR). Dans le présent travail, quelques modifications ont été apportées aux techniques publiées afin d’en améliorer les résultats. Ces résultats ont démontré que la paire d’amorce B4/B5 était la plus sensible pour détecter les échantillons positifs (98 %), la paire d’amorce JPF/JPR détectait 88,4 % des échantillons positifs alors que la paire d’amorce F4/R2 était la moins sensible, permettant de détecter 53,1 % des échantillons positifs seulement. La spécificité des 3 techniques était de 100 %. Les amorces B4/B5 permettaient aussi de détecter le nombre le plus faible de bactéries (700 ufc/mL) alors que les amorces JPF/JPR pouvaient détecter 7 × 105 ufc/mL et F4/R2, 7 × 107 ufc/mL. Nous avons donc conclu que l’utilisation des amorces de PCR B4/B5 avec les modifications de protocoles suggérées constitue un essai robuste qui remplit les exigences de sensibilité requises pour diagnostiquer en laboratoire la brucellose dans des échantillons de sang humain.

Document Type: Research Article

Publication date: May 1, 2008

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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