Structural elucidation of lipopolysaccharide core oligosaccharides from lic1 and lic1/lic2 mutants of Haemophilus influenzae type b strain Eagan

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The structures of lipopolysaccharides (LPSs) of lic1 and lic1/lic2 mutants from Haemophilus influenzae type b strain Eagan (RM153) were investigated using methylation analysis, electrospray ionization - mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy on O-deacylated, O- and N-deacylated core oligosaccharide (OS); and deacylated, dephosphorylated, and terminally reduced samples. The backbone OS derived from the major LPS glycoforms were determined to consist of the inner-core triheptosyl unit, l-α-d-Hepp-(1-2)-l-α-d-Hepp-(1-3)-l-α-d-Hepp-(1-, common to all H. influenzae strains investigated to date that is linked to the lipid A region of the molecule via a Kdo residue to which -d-Glcp and -d-Galp residues are attached in 1,4 and 1,2 linkages to the proximal (HepI) and distal (HepIII) heptose residues, respectively. It was found that the lic1 mutant predominately elaborates the Hex4 LPS glycoforms previously identified in the parent strain where a -d-Glcp-(1-4)-α-d-Glcp unit is linked in a 1,3 linkage to the central heptose (HepII) of the triheptosyl moiety. The lic1 locus consists of 4 genes (lic1A to lic1D) in a single transcriptional unit that directs phase variable expression of phosphocholine. The lic1A gene is phased off in the RM153 isolate of strain Eagan. LPS from the double mutant, lic1/lic2 had a similar structure to that of lic1 mutant except that there was no chain extension from the central heptose in the inner core (HepII). The lic2 locus consists of 4 genes (lic2A to lic2D). Our structural data were consistent with the proposed function of lic2C, providing the first definitive evidence for its role as the glycosyltransferase required for chain initiation from HepII. The presence of an O-acetyl group at O-3 of the distal heptose (HepIII) was elucidated by 1H NMR on the mild acid liberated core OS samples.

La structure des lipopolysaccharides (LPS) des mutants lic1 et lic1/lic2 de la souche de type b Eagan de Haemophilus influenzae (RM153) a été déterminée par des analyses de méthylation, par spectrométrie de masse à ionisation par electrospray et par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire. Des échantillons O-déacylés et O- et N-déacylés, le noyau, ainsi que des échantillons déacylés, déphosphorylés et réduits en position terminale (structure de base) ont été ainsi été examinés. Les oligosaccharides de base obtenus à partir des principales glycoformes de LPS consistent en un noyau tri-heptosyl l-α-d-Hepp-(1-2)-l-α-d-Hepp-(1-3)- l-α-D-Hepp-(1-, commun à toutes les souches de H. influenzae examinées à ce jour, qui est lié au lipide A de la molécule via un résidu Kdo auquel les résidus -d-Glcp et -d-Galp sont attachés par des liens 1,4 et 1,2 aux résidus heptoses proximal (Hep1) et distal (HepIII) respectivement. Le mutant lic1 élabore de faµon prédominante les glycoformes de LPS Hex4 identifiées précédemment chez la souche parente, où une unité -d-Glcp-(1-4)-α-d-Glcp est attachée par un lien 1,3 à l’heptose central (HepII). Le locus lic1 comprend quatre gÉnes (lic1A à lic1D) sur une seule unité de transcription qui rÉgle l’expression de la phosphocholine en fonction de la phase de croissance. Le gène licA est inactivé chez les isolats RM153 de la souche Eagan. Le LPS du double mutant lic1/lic2 possède une structure similaire que celle du mutant lic1 à l’exception du fait qu’il n’y pas d’extension de la chaîne à partir de l’heptose central du noyau (HepII). Le locus lic2 comprend quatre gènes (lic2A à lic2D). Nos données structurales sont cohérentes avec la fonction proposée de licC, fournissant la première preuve définitive de son rôle comme glycosyl transférase requise à l’initiation de la chaîne à partir de HepII. La présence d’un groupe O-acétyl en position O-3 de l’heptose distal (HepIII) a été élucidée par RMN H1 d’échantillons du noyau interne suivant un traitement acide doux.

Document Type: Research Article

Publication date: April 1, 2008

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