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Site-directed mutagenesis studies to probe the role of specific residues in the external loop (L3) of OmpF and OmpC porins in susceptibility of Serratia marcescens to antibiotics

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Serratia marcescens is a nosocomial bacterium with natural resistance to a broad spectrum of antibiotics, making treatment challenging. One factor contributing to this natural antibiotic resistance is reduced outer membrane permeability, controlled in part by OmpF and OmpC porin proteins. To investigate the direct role of these porins in the diffusion of antibiotics across the outer membrane, we have created an ompF–ompC porin-deficient strain of S.marcescens. A considerable similarity between the S.marcescens porins and those from other members of Enterobacteriaceae was detected by sequence alignment, with the exception of a change in a conserved region of the third external loop (L3) of the S.marcescens OmpC protein. Serratia marcescens OmpC has aspartic acid instead of glycine in position 112, methionine instead of aspartic acid in position 114, and glutamine in position 124, while in S.marcescens OmpF this is a glycine at position 124. To investigate the role of amino acid positions 112, 114, and 124 and how the observed changes within OmpC porin may play a part in pore permeability, 2 OmpC sites were altered in the Enterobacteriaceae consensus (D112G and M114D) through site-directed mutagenesis. Also, Q124G in OmpC, G124Q in OmpF, and double mutants of these amino acid residues were constructed. Antibiotic accumulation assays and minimal inhibitory concentrations of the strains harboring the mutated porins were performed, while liposome swelling experiments were performed on purified porins. Our results demonstrate that the amino acid at position 114 is not responsible for either antibiotic size or ionic selection, the amino acid at position 112 is responsible for size selection only, and position 124 is involved in both size and ionic selection.

Serratia marcescens est une bactérie nosocomiale possédant une résistance naturelle à un large spectre d’antibiotiques, rendant son traitement difficile. La perméabilité réduite de la membrane externe, contrôlée par les porines OmpF et OmpC, est un facteur qui contribue à cette résistance naturelle aux antibiotiques. Afin d’examiner le rôle direct de ces porines dans la diffusion des antibiotiques à travers la membrane externe, nous avons créé une souche de S.marcescens déficiente en ompF–ompC. Une similarité considérable a été trouvée entre les porines de S.marcescens et celles d’autres membres des Enterobacteriaceae par un alignement de séquences, à l’exception d’un changement au sein d’une région conservée de la troisième boucle externe (L3) de la protéine OmpC de S.marcescens. OmpC de S.marcescens possède un acide aspartique plutôt qu’une glycine en position 112, une méthionine plutôt qu’un acide aspartique en position 114 et une glutamine en position 124, alors que dans OmpF de S.marcescens, ce résidu est une glycine. Afin de déterminer le rôle des acides aminés situés en position 112, 114 et 124, et déterminer comment les changements observés au sein de la porine OmpC peuvent contribuer à la perméabilité du pore, deux sites chez OmpC ont été modifiés à l’intérieur de la séquence consensus des Enterobacteriaceae (D112G et M114D) par mutagenèse dirigée. De même, Q124G de OmpC et G124Q de OmpF, ainsi que des doubles mutants ont été construits. Des essais d’accumulation d’antibiotiques et les concentrations minimale inhibitrice des souches exprimant ces porines mutées ont été effectués, alors que des expériences de gonflement de liposomes ont été réalisées avec les porines purifiées. Nos résultats démontrent que l’acide aminé situé en position 114 n’est ni responsable de la sélection selon la taille de l’antibiotique ni de la sélection ionique, l’acide aminé situé en position 112 est responsable de la sélection selon la taille alors que l’acide aminé situé en position 124 est impliqué dans les deux types de sélection, selon la taille et ionique.

Document Type: Research Article

Publication date: June 1, 2007

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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