Blind trials evaluating in vitro infectivity of Cryptosporidium oocysts using cell culture immunofluorescence

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Abstract:

An optimized cell cultureimmunofluorescence (IFA) procedure, using the HCT-8 cell line, was evaluated in blind trials to determine the sensitivity and reproducibility of measuring the infectivity of flow-cytometry-prepared inocula of Cryptosporidium parvum oocysts. In separate trials, suspensions consisting of between 0% and 100% viable oocysts were prepared at the US Environmental Protection Agency, shipped to the American Water Laboratory, and analyzed blindly by cell culture IFA. Data indicated the control (100% live) oocyst suspensions yielded statistically similar results to cell culture dose–response curve data developed previously at the American Water Laboratory. For test samples containing oocyst suspensions of unknown infectivity, cell culture IFA analyses indicated a high degree of correlation (r2 = 0.89; n= 26) with the values expected by the US Environmental Protection Agency. Cell culture infectivity correlates well with neonatal mouse infectivity assays, and these blind validation trials provide credibility for the cell culture IFA procedure as a cost-effective and expedient alternative to mouse infectivity assays for determining in vitro infectivity of C.parvum oocysts.

Un protocole optimisé d’immunofluorescence (IFA) sur des cellules en culture, soit les cellules de la lignée HCT-8, a été utilisé lors d’essais à l’aveugle afin d’en déterminer la sensibilité et la reproductibilité lors de mesures de l’infectivité d’inoculats d’oocystes de Cryptosporidium parvum préparés par cytométrie de flux. Lors d’essais individuels, des suspensions comportant entre 0%– 100 % d’oocystes viables ont été préparées à l’Agence de protection de l’environnement des Etats-Unis, envoyées au Laboratoire des eaux des Etats-Unis et analysées à l’aveugle par IFA sur culture cellulaire. Les résultats indiquent que les suspensions contrôles d’oocystes (viables à 100 %) donnaient des résultats statistiquement similaires aux résultats de courbes dose–réponse de culture cellulaires précédemment obtenues au Laboratoire des eaux. Quant aux échantillons contenant des suspensions d’oocystes d’infectivité inconnue, les analyses en IFA sur culture cellulaire indiquaient un haut degré de corrélation (r2= 0,89; n= 26) avec les valeurs attendues par l’Agence de protection de l’environnement des Etats-Unis. L’infectivité sur culture de cellules corrèle bien avec l’infectivité déterminée par des essais sur des souris néonatales. Cette validation à l’aveugle donne de la crédibilité aux protocoles d’IFA sur culture cellulaire et fournit une alternative rapide aux essais d’infectivité chez la souris afin de déterminer l’infectivité d’oocystes de C. parvum.

Document Type: Research Article

Publication date: May 1, 2007

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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