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An efficient system for markerless gene replacement applicable in a wide variety of enterobacterial species

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Abstract:

We describe an improved allelic-exchange method for generating unmarked mutations and chromosomal DNA alterations in enterobacterial species. Initially developed for use in Salmonella enterica, we have refined the method in terms of time, simplicity, and efficiency. We have extended its use into related bacterial species that are more recalcitrant to genetic manipulations, including enterohemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli and Vibrio parahaemolyticus. Data from over 50 experiments are presented including gene inactivations, site-directed mutagenesis, and promoter exchanges. In each case, desired mutations were identified by polymerase chain reaction screening typically from as few as 10–20 colonies up to a maximum of 300 colonies. The method does not require antibiotic nor nutritional markers in target genes and works efficiently in wild-type strains, obviating the need for specialized hosts or genetic systems. The use is simple, requiring basic laboratory materials, and represents an alternative to existing methods for gene manipulation in the Enterobacteriaceae.Key words: allelic exchange, temperature-sensitive plasmids.

Nous décrivons une méthode améliorée d'échange allélique afin de générer des mutations invisibles et des altérations de l'ADN chromosomique chez des espèces d'entérobactéries. Développée initialement pour être utilizée chez Salamonella enterica, nous avons raffiné cette méthode en termes de temps, de simplicité et d'efficacité. Nous avons étendu son utilization à des espèces bactériennes reliées qui sont plus récalcitrantes aux manipulations génétiques, y compris Escherichia coli entéro-hémorragique et entéro-pathogénique de même que Vibrio parahaemolyticus. Les données recueillies à partir de plus de 50 expériences sont présentées, dont des inactivations géniques, de la mutagenèse dirigée et des échanges de promoteurs. Dans chaque cas, les mutations désirées étaient identifiées par criblage réaction en chaîne de la polymérase, typiquement à partir d'aussi peu que 10 à 20 colonies, jusqu'à un maximum de 300 colonies. Cette méthode ne requiert pas de la présence de marqueurs de résistance aux antibiotiques ni de marqueurs nutritionnels dans les gènes cibles et fonctionne efficacement chez les souches sauvages, évitant ainsi de recourir à des hôtes ou à des systèmes génétiques spécialisés. Son utilization est simple, ne requiert que du matériel de laboratoire de base et représente une alternative aux méthodes existantes de manipulations géniques chez les Entérobactériacées.Mots clés : échange allélique, plasmides thermosensibles.[Traduit par la Rédaction]

Document Type: Research Article

Publication date: January 1, 2007

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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