Potential pitfalls in the quantitative molecular detection of Escherichia coli O157:H7 in environmental matrices

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Abstract:

The detection sensitivity and potential interference factors of a commonly used assay based on real-time polymerase chain reaction (PCR) for Escherichia coli O157:H7 using eae gene-specific primers were assessed. Animal wastes and soil samples were spiked with known replicate quantities of a nontoxigenic strain of E. coli O157:H7 in a viable or dead state and as unprotected DNA. The detection sensitivity and accuracy of real-time PCR for E. coli O157:H7 in animal wastes and soil is low compared to enrichment culturing. Nonviable cells and unprotected DNA were shown to produce positive results in several of the environmental samples tested, leading to potential overestimates of cell numbers due to prolonged detection of nonviable cells. This demonstrates the necessity for the specific calibration of real-time PCR assays in environmental samples. The accuracy of the eae gene–based detection method was further evaluated over time in a soil system against an activity measurement, using the bioluminescent properties of an E. coli O157:H7 Tn5luxCDABE construct. The detection of significant numbers of viable but nonculturable (VBNC) as well as nonviable and possibly physically protected cells as shown over a period of 90 days further complicates the use of real-time PCR assays for quick diagnostics in environmental samples and infers that enrichment culturing is still required for the final verification of samples found positive by real-time PCR methods.Key words: Escherichia coli O157:H7, real-time PCR, animal waste, soil, VBNC.

Nous avons évalué la sensibilité de la détection et les facteurs d'interférence possibles d'un test commun basé sur le réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en temps réel pour déceler Escherichia coli O157:H7 en employant des amorces spécifiques au gène eae. Des déchets d'animaux et des échantillons de sol ont été ensemencés avec des quantités mesurées d'une souche non toxigène de E. coli O157:H7 dans un état viable ou mort ou sous forme d'ADN non protégé. La sensibilité de détection et la précision du PCR en temps réel pour E. coli O157:H7 dans les déchets d'animaux et dans le sol sont basses comparativement à la culture d'enrichissement. Les cellules non viables et l'ADN non protégé ont généré des résultats positifs dans plusieurs des échantillons environnementaux menant à une surestimation possible du nombre de cellules attribuable à une détection prolongée des cellules non viables, ce qui démontre la nécessité d'une calibration spécifique des tests de PCR en temps réel chez les échantillons environnementaux. L'évaluation de la précision de la méthode de détection basée sur le gène eae s'est poursuivie à travers le temps dans un système de sol avec pour référence la mesure de l'activité utilisant les propriétés bioluminescentes d'une construction Tn5luxCDABE chez E. coli. La détection d'un nombre significatif de CVNC (cellules viables mais non cultivables) de même que des cellules non viables et probablement physiquement protégées tel que démontré sur une période de 90 jours complique davantage l'utilisation des tests de PCR en temps réel chez des échantillons environnementaux pour des diagnostics rapides et indique que la culture d'enrichissement est encore nécessaire à la vérification finale d'échantillons s'étant révélés positifs par des méthodes de PCR en temps réel.Mots clés : Escherichia coli O157:H7, PCR en temps réel, déchets d'animaux, sol, CVNC.[Traduit par la Rédaction]

Document Type: Research Article

Publication date: May 1, 2006

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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