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Isolation and characterization of chitinases from Verticillium lecanii

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Degenerate PCR primers corresponding to conserved domains of fungal chitinases were designed, and PCR was performed on genomic DNA of the entomogenous fungus Verticillium lecanii (Zimmermann) Viegas. Two distinct PCR fragments, chf1 and chf2, were isolated and used to identify two DNA contigs. Analyses of these two contigs revealed that we had obtained the full-length DNA sequence including the promoter, 5′ untranslated region, open reading frame (ORF), and 3′ untranslated regions for two distinct chitinase-like genes. These two genomic DNA sequences exhibited 51% identity at the amino acid (aa) level and were designed as acidic (chi1) and basic (chi2) chitinase-like genes. The isolated cDNA for chi1 gene is 1110 bp with a predicted protein of 370 aa and molecular mass of 40.93 kDa, and its ORF was uninterrupted in its corresponding genomic DNA sequence. The cDNA for the chi2 gene is 1269 bp, a predicted ORF of 423 aa and molecular mass of 45.95 kDa. In contrast, the ORF was interrupted by three introns in its corresponding genomic DNA. The basic chitinase gene (chi2) was successfully expressed in the Pichia pastoris system; optimum enzymatic activity was observed at 22 °C and at pH 7.5. CHI1 and CHI2 were clustered into two different phylogenetic groups according to their sequence alignments with 28 other fungal chitinases. A chitin-binding domain, comprising two sub-domains that exhibit similarities at the aa level to chitin binding domains in bacteria, was identified in 30 fungal chitinase sequences examined.Key words: fungus, chitin, cloning, sequencing, transformation, Pichia sp. expression.

Des amorces dégénérées de PCR correspondant à des domaines conservés chez plusieurs chitinases de différents champignons ont été identifiées et utilisées avec l'ADN génomique du champignon entomopathogénique Verticillium lecanii (Zimmermann) Viegas. Deux fragments distincts d'ADN, chf1 et chf2, ont été amplifiés, isolés et utilisés pour l'identification de deux contigs. L'analyse de ces deux contigs d'ADN a révélé que la séquence complète, incluant le promoteur, la région 5′ non-traduite, le gène (ORF) et la région 3′ non-traduite, a été obtenue pour deux gènes putatifs de chitinase. Ces deux séquences génomiques ont un niveau d'identité entre leur acides aminés (aa) de 51 % et correspondent à des chitinases acide (chi1) et basique (chi2). En utilisant l'information des séquences génomiques, des séquences correspondantes d'ADNc ont également été identifiées en utilisant le PCR. L'ADNc de chi1 est composé de 1110 pb encodant une protéine de 370 aa et d'une masse moléculaire de 40,93 kDa. La séquence n'est pas interrompue par un intron. L'ADNc de chi2 est composé de 1269 pb encodant une protéine de 423 aa et d'une masse moléculaire de 45,95 kDa. Toutefois, la séquence génomique est interrompue par trois introns. La chitinase basique (chi2) a été exprimée dans le système de levure de Pichia pastoris et nous avons determiné que la température de 22 °C et le pH de 7,5 étaient optimum pour l'activité enzymatique. CHI1 et CHI2 ont été regroupés dans deux groupes différents suite à une analyse phylogénique en comparaison avec 28 autres chitinases de champignons. Un domaine permettant la liaison au substrat et composé de deux sous domaines, similaire au domaine préalablement identifié chez les chitinases d'origine bactérienne a aussi été identifié chez les 30 chitinases de champignons évaluées.Mots clés : champignon, chitine, clonage, séquençage, transformation, expression de Pichia sp.

Document Type: Research Article

Publication date: December 1, 2005

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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