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Real-time quantitative PCR for enteric adenovirus serotype 40 in environmental waters

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Abstract:

Adenoviruses 40 and 41 have been recognized as important etiological agents of gastroenteritis in children. A real-time PCR method (TaqMan® assay) was developed for rapid quantification of adenovirus 40 (Ad40) by amplifying an 88 bp sequence from the hexon gene. To establish a quantification standard curve, a 1090 bp hexon region of Ad40 was amplified and cloned into the pGEM®-T Vector. A direct correlation was observed between the fluorescence threshold cycle number (Ct) and the starting quantity of Ad40 hexon gene. The quantification was linear over 6-log units and the amplification efficiency averaged greater than 95%. Seeding studies using various environmental matrices (including sterile water, creek water, brackish estuarine water, ocean water, and secondary sewage effluent) suggest that this method is applicable to environmental samples. However, real-time PCR was sensitive to inhibitors present in the environmental samples. Lower efficiency of PCR amplification was found in secondary sewage effluent and creek waters. Application of the method to fecal contaminated waters successfully quantified the presence of Ad40. The sensitivity of the real-time PCR is comparable to the traditional nested PCR assay for environmental samples. In addition, the real-time PCR assay offers the advantage of speed and insensitivity to contamination during PCR set up. The real-time PCR assay developed in this study is suitable for quantitative determination of Ad40 in environmental samples and represents a considerable advancement in pathogen quantification in aquatic environments.Key words: adenovirus, real-time PCR, environmental waters, serotype 40.

Les adénovirus 40 et 41 sont reconnus comme étant des agents étiologiques importants de la gastro-entérite juvénile. Une méthode de PCR en temps réel (essai TaqMan®) a été conçue pour la quantification rapide d'adénovirus 40 (Ad40) par l'amplification d'une séquence de 88 pb provenant du gène de l'hexon. Afin de générer une courbe de concordance de quantification, une région de 1090 pb de l'hexon de Ad40 été amplifié et cloné dans le vecteur pGEM®-T. Une corrélation directe fut observée entre la fluorescence du seuil de nombre de cycles et la quantité de départ du gène de l'hexon de Ad40. La quantification était linéaire sur 6 unités logarithmiques et l'efficacité moyenne d'amplification était supérieure à 95 %. Des études d'ensemencement utilisant diverses matrices environnementales incluant de l'eau stérile, de l'eau de ruisseaux, de l'eau saumâtre d'estuaire, de l'eau de mer et des effluents secondaires d'égouts indiquent que cette méthode est applicable à des échantillons environnementaux. Toutefois, le PCR en temps réel était sensible aux inhibiteur présent dans les échantillons environnementaux. Une efficacité inférieure d'identification par PCR fut notée dans les eaux issues d'effluents d'égouts secondaires et de ruisseaux. L'application de cette méthode à des eaux contaminées par des matières fécales ont pu quantifier avec succès la présence de Ad40. La sensibilité du PCR en temps réel était comparable aux tests traditionnels de PCR nidifié sur les échantillons environnementaux. De plus, le test de PCR en temps réel offre l'avantage de la rapidité et de l'insensi bilité à la contamination lors de la préparation du PCR. Le test de PCR en temps réel élaboré dans cette étude est approprié pour le dénombrement de Ad40 dans les échantillons environnementaux et représente un progrès considérable pour la quantification de pathogènes dans des environnements aquatiques.Mots clés : adénovirus, PCR en temps réel, eaux environnementales, sérotype 40.[Traduit par la Rédaction]

Document Type: Research Article

Publication date: 2005-05-01

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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