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Direct cloning of genes encoding novel xylanases from the human gut

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Abstract:

The aim of this study was to identify a novel 1,4--xylanase gene from the mixed genome DNA of human fecal bacteria without bacterial cultivation. Total DNA was isolated from a population of bacteria extracted from fecal microbiota. Using PCR, the gene fragments encoding 5 different family 10 xylanases (xyn10A, xyn10B, xyn10C, xyn10D, and xyn10E) were found. Amino acid sequences deduced from these genes were highly homologous with those of xylanases from anaerobic intestinal bacteria such as Bacteroides spp. and Prevotella spp. Self-organizing map (SOM) analysis revealed that xynA10 was classified into Bacteroidetes. To confirm that one of these genes encodes an active enzyme, a full-length xyn10A gene was obtained using nested primers specific to the internal fragments and random primers. The xyn10A gene encoding the xylanase Xyn10A consists of 1146 bp and encodes a protein of 382 amino acids and a molecular weight of 43 552. Xyn10A was a single module novel xylanase. Xyn10A was purified from a recombinant Escherichia coli strain and characterized. This enzyme was optimally active at 40 °C and stable up to 50 °C at pH 6.5 and over the pH range 4.0–11.0 at 25 °C. In addition, 2 ORFs (ORF1 and ORF2) were identified upstream of xyn10A. These results suggested that many unidentified xylanolytic bacteria exist in the human gut and may contribute to the breakdown of xylan which contains dietary fiber.Key words: xylanase, human gut, fecal microbiota, phylogenetic analysis, self-organizing map.

Le but de cette étude fut d'identifier de nouveaux gènes de 1,4--xylanases à partir d'ADN génomiques mélangés de bactéries fécales humaines sans culture bactérienne. L'ADN total fut isolé à partir d'une population de bactéries extraite de la microflore fécale. À l'aide du PCR, les fragments géniques codant 5 différentes xylanases de la famille numéro 10 (xyn10A, xyn10B, xyn10C, xyn10D et xyn10E) ont été trouvées. Les séquences en acides aminés déduites de ces gènes étaient fortement homologues à celles de xylanases provenant de bactéries intestinales anaérobies telles que Bacteroides et Prevotella spp. Une analyse de « self-organizing map » (SOM) a révélé que xyn10A était classifié à l'intérieur des Bacteroidetes. Afin de confirmer que l'un de ses gènes codait une enzyme active, le gène complet de xyn10A a été obtenu à l'aide d'amorces nidifiées spécifiques aux fragments internes et d'amorces aléatoires. Le gène xyn10A codant la xylanase Xyn10A est composé de 1146 pb et code une protéine de 382 acides aminés ayant une masse moléculaire de 43 552. Xyn10A représente une nouvelle xylanase à module unique. Xyn10A a été purifiée à partir d'une souche de Escherichia coli recombinante et fut caractérisée. Cette enzyme avait une activité optimale à 40 °C et était stable jusqu'à 50 °C à un pH de 6,5 et dans un intervalle de pH de 4,0 à 11,0 à 25 °C. De plus, 2 cadres de lecture ouverts (ORF1 et ORF2) ont été identifiés en amont de xyn10A. Ces résultats indiquent que plusieurs bactéries xylanolytiques non identifiées existent dans l'intestin humain et pourrait participer à la dégradation du xylane contenu dans les fibres alimentaires.Mots clés : xylanase, intestin humain, microflore fécale, analyses phylogénétiques, self-organizing map.[Traduit par la Rédaction]

Document Type: Research Article

Publication date: 2005-03-01

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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