Cloning and expression of the Clostridium thermocellum L-lactate dehydrogenase gene in Escherichia coli and enzyme characterization

Authors: Özkan, Melek; Yllmaz, Ebru I; Lynd, Lee R; Özcengiz, Gülay

Source: Canadian Journal of Microbiology, Volume 50, Number 10, October 2004 , pp. 845-851(7)

Publisher: NRC Research Press

Buy & download fulltext article:

OR

Price: $50.00 plus tax (Refund Policy)

Abstract:

The structural gene for L-lactate dehydrogenase (LDH) (EC.1.1.1.27) from Clostridium thermocellum 27405 was cloned in Escherichia coli by screening the Lambda Zap II phage library of C. thermocellum genomic DNA. In one positive clone, an open reading frame of 948 base pairs corresponded to C. thermocellum ldh gene encoding for the predicted 315-residue protein. The ldh gene was successfully expressed in E. coli FMJ39 (ldh mutant) under the lac promoter. The recombinant enzyme was partially purified from E. coli cell extracts and its kinetic properties were determined. Clostridium thermocellum LDH was shown to catalyze a highly reversible reaction and to be an allosteric enzyme that is activated by fructose-1,6-diphosphate (FDP). For pyruvate, partially purified LDH had Km and Vmax values of 7.3 mmol/L and 87 µmol/min, respectively, and in the presence of FDP, a 24-fold decrease in Km and a 5.7-fold increase in Vmax were recorded. The enzyme exhibited no marked catalytic activity for lactate in the absence of FDP, whereas Km and Vmax values were 59.5 mmol/L and 52 µmol/min, respectively, in its presence. The enzyme did not lose activity when incubated at 65 °C for 5 min.Key words: L-lactate dehydrogenase purification, thermophilic bacteria.

Le gène structural de la L-lactate déshydogénase (LDH; EC.1.1.1.27) de Clostridium thermocellum 27405 a été cloné chez Escherichia coli suite à un criblage d'une banque de phages Lambda Zap II d'ADN génomique de C. thermocellum. Dans le clone positif, un cadre de lecture ouvert de 948 pb correspondait au gène ldh de C. thermocellum codant la protéine prédite de 315 résidus. Le gène ldh a été exprimé avec succès chez E. coli FMJ39 (mutant ldh) sous le contrôle du promoteur lac. L'enzyme recombinante a été partiellement purifiée d'extraits cellulaires de E. coli et ses propriétés cinétiques ont été déterminées. Il fut démontré que la LDH de C. thermocellum pouvait catalyser une réaction hautement réversible et était une enzyme allostérique activée par le fructose-1,6-diphosphate (FDP). Pour le pyruvate, la LDH partiellement purifiée avait un Km 7,3 mmol/L et un Vmax de 87 µmol/min; en présence de FDP, nous avons noté une diminution du Km d'un facteur de 24 et une augmentation d'un facteur de 5,7 du Vmax. L'enzyme n'a démontré aucune activité catalytique notable pour le lactate en l'absence de FDP, alors que les valeurs de Km et de Vmax étaient respectivement de 59,5 mol/L et 52 µmol/min en sa présence. L'enzyme n'a pas perdu son activité lorsqu'elle fut incubée à 65 °C pendant 5 minutes.Mots clés : purification de la L-lactate déshydogénase, bactéries thermophiles.[Traduit par la Rédaction]

Document Type: Research Article

Publication date: October 1, 2004

More about this publication?
  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
  • Information for Authors
  • Submit a Paper
  • Subscribe to this Title
  • Terms & Conditions
  • Sample Issue
  • Reprints & Permissions
  • ingentaconnect is not responsible for the content or availability of external websites
Related content

Tools

Key

Free Content
Free content
New Content
New content
Open Access Content
Open access content
Subscribed Content
Subscribed content
Free Trial Content
Free trial content

Text size:

A | A | A | A
Share this item with others: These icons link to social bookmarking sites where readers can share and discover new web pages. print icon Print this page