Transfer of a plant chitinase gene into a nitrogen-fixing Azospirillum and study of its expression

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Abstract:

Azospirillum is used extensively in rice and other cereal crops as a biofertilizer. There is a substantial opportunity to improve the efficiency of this bacterium through the transfer of genes of agricultural importance from other organisms. Chitinases are antifungal proteins, and expression of chitinase genes in Azospirillum would help to develop strains with potential antifungal activities. So far there are no reports about transfer of plant genes into Azospirillum and their expression. The present study was aimed at expressing an antifungal gene (a rice chitinase) of plant origin in Azospirillum brasilense. A rice chitinase cDNA (RC 7) that codes for a 35 kDa protein was subcloned into a broad host range plasmid pDSK519 under the control of LacZ promoter. The plasmid was mobilized into the nitrogen-fixing bacterium, Azospirillum brasilense strain SP51eFL1, through biparental mating. The conjugation frequency was in the range of 35–40 × 10–6. The transconjugants grew in nitrogen-free media and fixed gaseous nitrogen in vitro. However, their growth and nitrogen-fixing ability were slightly less than those of the wild-type. Expression of the protein was demonstrated through western blotting of the total cell protein, which detected a 35 kDa band that was immuno-reactive to a barley chitinase antibody. The cell lysates also hydrolyzed various chitin substrates, which resulted in release of free sugars demonstrating the chitinase activity of transconjugants. The expressed protein also had antifungal activity as demonstrated by inhibition of growth of the plant pathogenic fungus, Rhizoctonia solani.Key words: Azospirillum-transformation, rice chitinase gene, protein expression, chitinase activity.

Azospirillum est utilisé abondamment dans les cultures de riz et d'autres céréales en tant qu'engrais biologique. Il serait possible d'améliorer l'efficacité de cette bactérie par le transfert de gènes d'importance agricole à partir d'autres organismes. Les chitinases sont des protéines antifongiques dont l'expression chez Azospirillum permettrait de concevoir des souches démontrant des activités antifongiques potentielles. Jusqu'à maintenant, il n'existe aucun cas rapporté de transfert de gènes de plantes chez Azospirillum et de leur expression. L'étude présente avait pour objectif d'exprimer un gène antifongique (une chitinase de riz) d'origine végétale chez Azospirillum brasilense. Un ADNc de chitinase de riz (RC 7) codant une protéine de 35 kDa a été sous-cloné dans le plasmide pDSK519 à large spectre d'hôte sous le contrôle du promoteur LacZ. Le plasmide a été mobilisé dans la bactérie fixatrice d'azote, Azospirillum brasilense souche SP51eFL1, par accouplement biparental. La fréquence de conjugaison se situait autour de 35–40 × 10-6. Les transconjugants ont poussé dans un milieu sans azote et ont fixé l'azote gazeux in vitro. Toutefois, leur croissance et leur capacité à fixer l'azote étaient légèrement inférieures à celles du type sauvage. L'expression de la protéine fut démontrée par immunobuvardage de type Western des protéines cellulaires totales, ce qui a permis la détection d'une bande de 35 kDa qui fut révélée par un anticorps dirigé contre la chitinase de l'orge. Les lysats cellulaires ont également hydrolysé divers substrats de chitine, ce qui a entraîné la libération de sucres libres, démontrant ainsi l'activité de la chitinase dans les transconjugants. La protéine exprimée possédait également une activité antifongique, tel que démontré par l'inhibition de la croissance du champignon pathogène des plantes, Rhizoctonia solani.Mots clés : transformation d'Azospirillum, gènes de la chitinase de riz, expression de protéines, activité chitinase.[Traduit par la Rédaction]

Document Type: Research Article

Publication date: July 1, 2004

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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