Use of PCR–RFLP for genotyping 16S rRNA and characterizing bacteria cultured from halibut fry

Authors: Jensen, S.; Bergh; Enger; Hjeltnes, B.

Source: Canadian Journal of Microbiology, Volume 48, Number 5, May 2002 , pp. 379-386(8)

Publisher: NRC Research Press

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Abstract:

Small subunit ribosomal genes were explored using PCR–RFLP to facilitate the characterization of bacteria cultured from reared fry of the Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus). Concern has been expressed about pathogen invasion in larvae lacking a counteracting normal flora that may aid the immune system in producing robust noninfected individuals. In this study, pure cultured representatives of normal flora that were previously found to be antagonistic towards a pathogenic Vibrio sp. were subjected to a whole cell PCR protocol amplifying ~1500 bp of 16S rDNA. Amplified DNA was digested by AluI, BstUI, CfoI, and RsaI, to generate restriction profiles. Before the isolates were characterized, a survey was performed to test the discriminative efficiency of the RFLP. Efficient detection of polymorphism and the resolution of species and subspecies were achieved. Using the RFLP on 103 isolates generated as many as 22 genotypes. Based on the restriction profiles, a taxonomic tree incorporating 19 reference strains was constructed. Partial sequencing found this tree to be dominated by -Proteobacteria in clusters of Vibrio-, Pseudomonas-, and Alteromonas-affiliated species. Only nine isolates fell outside these genera, including the three isolates Shewanella alga, Deleya marina, and Marinomonas protea. These species have not previously been reported as halibut flora. The most frequently isolated genotype resembled Vibrio salmonicida.Key words: halibut, Vibrio, RFLP, 16S rDNA, phylogeny.

Les gènes des petites sous-unités ribosomiques ont été étudiés par PCR–RFLP pour faciliter la caractérisation des bactéries récoltées d'un élevage d'alevins de flétan de l'Atlantique (Hippoglossus hippoglossus). Des questions se sont posées sur l'invasion des pathogènes chez des larves dépourvues d'une flore normale dont le rôle est d'empêcher l'invasion et qui pourrait aider le système immunitaire à produire des poissons non infectés robustes. Dans notre étude, des cultures pures de bactéries de la flore normale, reconnues comme antagonistes du pathogène Vibrio sp., ont été soumises à un protocole PCR utilisant des cellules entières qui permet d'amplifier ~1500 pb de l'ADN r16S. L'ADN amplifié a été digéré par les enzymes AluI, BstUI, CfoI et RsaI pour générer des profils de restriction. Avant de caractériser les isolats, une étude a été complétée pour vérifier le pouvoir de discrémination de RFLP. Nous avons ainsi détecté efficacement le polymorphisme et obtenu une résolution de l'espèce et des sous-espèces. L'utilisation de RFLP sur 103 isolats a généré jusqu'à 22 génotypes. D'après les profils de restriction, nous avons construit un arbre taxinomique incluant 19 souches de référence. Un séquençage partiel a établi que cet arbre était dominé par les -Proteobacteria avec des groupes d'espèces affiliées à Vibrio, Pseudomonas et Alteromonas. Seulement neuf isolats ne pouvaient être inclus dans ces genres et ils appartenaient à trois espèces : Shewanella alga, Deleya marina et Marinomonas protea. Ces espèces ne sont pas connues jusqu'ici comme membres de la flore du flétan. Le génotype le plus fréquemment isolé ressemblait à Vibrio salmonicida.Mots clés : flétan, Vibrio, RFLP, ADN r16S, phylogénie.

Keywords: 16S rDNA; ADN r16S; RFLP; Vibrio; flétan; halibut; phylogeny; phylogénie

Document Type: Research Article

Publication date: May 1, 2002

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