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Development of a method for mRNA differential display in filamentous fungi: comparison of mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction and cDNA amplified fragment length polymorphism in Leptosphaeria maculans

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Abstract:

We modified a technique, cDNA-AFLP, for identifying differentially expressed genes in plants to work in the filamentous fungus Leptosphaeria maculans (Desmaz.) Ces. & De Not. The cDNA fragments generated by our method ranged in size from approximately 100 to 400 bps. On average, twice as many cDNA fragments were amplified per primer set with cDNA amplified fragment length polymorphism in comparison with mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction. The DNA fragments of interest were excised from gels and analyzed by single-stranded conformation polymorphism to eliminate nondifferentially expressed cDNA contamination. The method was used to examine gene expression differences between cultures grown in the presence or absence of an analog of the Brassica phytoalexin brassinin. Eleven of the fourteen fragments examined were determined by reverse Northern blot to be differentially expressed. In examining gene expression differences between young cultures not producing sirodesmins and older cultures that were producing these phytotoxins, we found 17 of 25 fragments were differentially expressed. Northern blots with these fragments confirmed the results.Key words: Phoma lingam, ascomycete, blackleg, Brassica.

Nous avons modifié une technique, cDNA-AFLP, pour identifier des gènes exprimés différemment chez les plantes lors d'une étude chez le champignon filamenteux Leptosphaeria maculans (Desmaz.) Ces. & De Not. Les fragments d'ADNc générés par cette méthode avaient une taille approximative variant de 100 à 400 pbs. En moyenne, deux fois plus de fragments d'ADNc ont été amplifiés par groupe d'amorces avec les polymorphismes de longueur de fragments amplifiés d'ADN complémentaire en comparaison avec la RT-PCR sur les ARNm obtenus par présentation différentielle. Les fragments d'ADN intéressants ont été retirés des gels et analysés d'après le polymorphisme de confirmation des simples brins dans le but d'éliminer la contamination de l'ADNc exprimé de façon non différentielle. La méthode a été utilisée pour évaluer les différences d'expression des gènes entre des cultures faites en présence ou en absence d'un analogue de la brassinine, une phytoalexine de Brassica. Par buvardage Northern inversé, nous avons constaté que 11 des 14 fragments examinés étaient exprimés différemment. Une comparaison des différences dans l'expression des gènes entre des cultures jeunes ne produisant pas de sidérodesmines et des cultures plus âgées productrices de ces phytotoxines, a révélé que 17 des 25 fragments étaient exprimés différemment. Des buvardages Northern avec ces fragments ont confirmé ces résultats.Mots clés : Phoma lingam, ascomycètes, maladie de la jambe noire, Brassica.[Traduit par la Rédaction]

Keywords: Brassica; Phoma lingam; ascomycete; ascomycètes; blackleg; maladie de la jambe noire

Document Type: Research Article

Publication date: October 1, 2001

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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nrc/cjm/2001/00000047/00000010/art00010
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