Purification, cloning, and DNA sequence analysis of a chitinase from an overproducing mutant of Streptomyces peucetius defective in daunorubicin biosynthesis

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Extracellular chitinases of Streptomyces peucetius and a chitinase overproducing mutant, SPVI, were purified to homogeneity by ion exchange and gel filtration chromatography. The purified enzyme has a molecular mass of 42 kDa on SDS-PAGE, and the N-terminal amino acid sequence of the protein from the wild type showed homology to catalytic domains (Domain IV) of several other Streptomyces chitinases such as S. lividans 66, S. coelicolor A3(2), S. plicatus, and S. thermoviolaceus OPC-520. Purified SPVI chitinase cross-reacted to anti-chitinase antibodies of wild-type S. peucetius chitinase. A genomic library of SPVI constructed in E. coli using  DASH II was probed with chiC of S. lividans 66 to screen for the chitinase gene. A 2.7 kb fragment containing the chitinase gene was subcloned from a  DASH II clone, and sequenced. The deduced protein had a molecular mass of 68 kDa, and showed domain organization similar to that of S. lividans 66 chiC. The N-terminal amino acid sequence of the purified S. peucetius chitinase matched with the N-terminus of the catalytic domain, indicating the proteolytic processing of 68 kDa chitinase precursor protein to 42 kDa mature chitinase containing the catalytic domain only. A putative chiR sequence of a two-component regulatory system was found upstream of the chiC sequence.Key words: chitinase, chitinase purification, Streptomyces peucetius, daunorubicin, chiC.

Les chitinases de Streptomyces peucetius et une chitinase du mutant surproduisant la protéine furent purifiées jusqu'à homogénéité par échange d'ions et chromatographie de filtration en gel. L'enzyme purifiée a une masse moléculaire de 42 kDa tel que mesurée par SDS-PAGE; la séquence amino-terminale de la protéine du type sauvage a démontré un homologie avec les domaines catalytiques (Domaine IV) de plusieurs autres chitinases de Streptomyces tel que S. lividans 66, S. coelicolor A3(2), S. plicatus et S. thermoviolaceus OPC-520. La chitinase SPVI purifiée a démontré une réaction croisée avec des anticorps anti-chitinase dirigés contre la chitinase de S. peucetius de type sauvage. Une banque génomique de SPVI construite dans E. coli en utilisant  DASH II fut sondée avec chiC de S. lividans 66 afin de cribler pour le gène de la chitinase. Un fragment de 2.7 kb contenant le gène de la chitinase a été sous-cloné à partir d'un clone  DASH II, et séquencé. La protéine déduite avait un poids moléculaire de 68 kDa et l'arrangement de ses domaines était semblable à celui de chiC de S. lividans 66. La séquence amino-terminale de la chitinase purifiée de S. peucetius s'agença avec la terminaison aminée du domaine catalytique, évoquant par ce fait la protéolyse du précurseur protéique de 68 kDa de la chitinase en une chitinase mature de 42 kDa contenant seulement le domaine catalytique. Une séquence putative de chiR représentant un système régulateur à deux composantes fut découvert en amont de la séquence chiC.Mots clés : chitinase, purification de la chitinase, Streptomyces peucetius, daunorubicine, chiC.[Traduit par la Rédaction]

Keywords: Streptomyces peucetius; chiC; chitinase; chitinase purification; daunorubicin; daunorubicine; purification de la chitinase

Document Type: Research Article

Publication date: March 1, 2001

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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