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ICC/PCR detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples

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Abstract:

This study applied the integrated cell culture/polymerase chain reaction methodology (ICC/PCR) for rapid and specific detection of both cytopathogenic and noncytopathogenic viruses. Results of this study showed that the use of direct RT-PCR or conventional cell culture alone may yield erroneous results with the analysis of environmental samples. The purpose of this study was to compare cultural, molecular, and combined assays for the most effective method of virus detection in variable environmental samples. Using ICC/PCR, stock enterovirus inocula of 10 PFU were PCR positive in at least 4/5 replicate flasks after only 5 h of incubation in cell culture, and in all flasks after 10 h. An inoculum of one PFU was detected by PCR after 20 h of cell culture incubation while for concentrations of virus below one PFU, 25 h of incubation was sufficient. Similarly, hepatitis A virus (HAV) inocula of 100 MPN/flask, produced indeterminate CPE in cell culture, but were clearly detected by ICC/PCR following 48 h of incubation. Lower levels of HAV, 1 and 10 MPN, were detected by ICC/PCR after 96 to 72 h of incubation, respectively. Cell culture lysates from 11 environmental sample concentrates of sewage, marine water, and surface drinking water sources, were positive for enteroviruses by ICC/PCR compared to 3 positive by direct RT-PCR alone. Results from ICC/PCR eventually agreed with cell culture but required 48 h of incubation, compared to as long as 3 weeks for CPE following incubation with BGM and FRhK cells.Key words: RT-PCR, cell culture, ICC/PCR, enterovirus, hepatitis A virus.

Cette étude a mis en pratique la méthodologie de culture cellulaire/réaction de polymérase en chaîne intégrés (ICC/PCR) pour la détection rapide et spécifique de virus cytophathogènes et non-cytopathogènes. Les résultats de cette étude ont démontré que l'usage uniquement du RT-PCR direct ou de cultures cellulaires pouvait donner des résultats erronés lors de l'analyse d'échantillons environnementaux. L'objectif de cette étude était de comparer les analyses moléculaire, en culture, et combinées afin d'établir la méthode la plus efficace de détection de virus dans des échantillons environnementaux variables. En empruntant la méthode du ICC/PCR, des inoculums d'entérovirus stock de 10 UFP étaient positifs par PCR dans au moins 4/5 des flacons répliqués, après seulement 5 heures d'incubation en culture cellulaire, et dans tous les flacons après 10 heures. Une inoculum de 1 UFP fut détecté par PCR après 20 heures d'incubation en culture cellulaire, alors que 25 heures d'incubation furent insuffisantes pour détecter des concentrations de virus inférieures à un UFP. De manière analogue, des inoculums du virus de l'hépatite A (HAV) de 100 NNP/flacon ont produit des effets cytopathiques (ECP) indéterminés en culture cellulaire, mais étaient clairement détectables par ICC/PCR à la suite de 48 heures d'incubation. Des niveaux réduits de HAV, 1 et 10 NNP, ont été décelés par ICC/PCR après 96 et 72 h d'incubation, respectivement. Des lysats cellulaires de 11 échantillons concentrés provenant d'égouts, de sources d'eau marine et d'eau potable de surface, ont été déclarés positifs pour les entérovirus par ICC/PCR, comparativement à 3 par le RT-PCR direct uniquement. Les résultats de ICC/PCR ont éventuellement rencontré ceux de culture cellulaire, mais ont nécessité 48 heures d'incubation, comparativement à jusqu'à 3 semaines pour les ECP observés après incubation avec des cellules BGM et FRhK.Mots clés : RT-PCR, culture cellulaire, ICC/PCR, entérovirus, virus de l'hépatite A.[Traduit par la Rédaction]

Keywords: ICC/PCR; RT-PCR; cell culture; culture cellulaire; enterovirus; entérovirus; hepatitis A virus; virus de l'hépatite A

Document Type: Research Article

Publication date: 2001-02-01

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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