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Construction of a multiframe vector to express coding sequences in Escherichia coli

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Cloning of foreign DNA fragments for coding sequence analysis in Escherichia coli usually involves sets of three vectors. To simplify this, we constructed an expression vector named pMFV7 containing three ATG codons in different frames downstream of a Shine-Dalgarno sequence, assuming that the ribosome can use any of the three start codons in an alternative manner. Translation beginning at either of the start codons would drive the expression of any coding fragment cloned downstream. To test the feasibility of this proposal, we cloned DNA fragments of the lacZ gene in each of the possible reading frames downstream from pMFV7 start codons. Sequence analysis of the N-terminus regions around the fusion sites indicates that ribosomes indeed initiate translation at each of the three initiation codons. In one case, levels of -galactosidase activity depended largely on the N-terminus of the translation products. We conclude that pMFV7 may be useful for expressing coding sequences regardless of their reading frame.Key words: translation initiation, in-frame gene cloning, expression vectors.

Le clonage de fragments d'ADN étranger dans Escherichia coli pour fin d'analyse de séquences codantes implique l'utilisation de jeux de trois vecteurs. Afin de simplifier ceci, nous avons construit un vecteur d'expression appelé pMFV7 et contenant trois codons ATG placés dans différents cadres en aval d'une séquence de Shine-Delgarno, en présumant que le ribosome pourrait utiliser optionnellement n'importe lequel des trois codons de départ. La traduction qui s'amorcerait à l'un ou l'autre des codons de départ mènerait à l'expression de tout fragment codant cloné en aval. Pour vérifier la faisabilité de cette approche, nous avons cloné des fragments d'ADN du gène lacZ dans chacun des cadres de lecture potentiels en aval des codons de départ de pMFV7. L'analyse des séquences des régions amino-terminales aux environs des sites de fusion indique que les ribosomes ont effectivement initié la traduction à chacun des trois codons d'initiation. À une occasion, les niveaux d'activité de la -galactosidase étaient essentiellement dépendants de la partie amino-terminale des produits de la traduction. Nous concluons que pMFV7 pourrait être utile pour l'expression de séquences codantes, sans égard à leur cadre de lecture.Mots clés : initiation de la traduction, clonage de gènes en phase, vecteurs d'expression.[Traduit par la Rédaction]

Keywords: expression vectors; in-frame gene cloning; translation initiation

Document Type: Research Article

Publication date: January 1, 2001

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  • Published since 1954, this monthly journal contains new research in the field of microbiology including applied microbiology and biotechnology; microbial structure and function; fungi and other eucaryotic protists; infection and immunity; microbial ecology; physiology, metabolism and enzymology; and virology, genetics, and molecular biology. It also publishes review articles and notes on an occasional basis, contributed by recognized scientists worldwide.
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