Authors: Chan, Jayna; Huang, Zuyun; Watt, Ian; Kille, Peter; Stillman, Martin J.

Source: Canadian Journal of Chemistry, Volume 85, Number 10, October 2007 , pp. 898-912(15)

Publisher: NRC Research Press

Abstract:

Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) data and molecular modeling calculations were used to gain mechanistic, conformational, and domain-specific information from the acid-induced demetallation reactions of human metallothionein. The recombinant proteins studied were the single α- and β-rhMT-1a domains and the βα- and αβ-rhMT-1a two-domain species, based on the human metallothionein 1a sequence. Complete molecular models (MM3/MD) for all the fully metallated and demetallated species using a modified force field are reported for the first time. Basic residues that contribute to the ESI-MS charge states are identified from the molecular models. Demetallation took place under equilibrium conditions within a narrow pH range. For the two-domain proteins, these results support a demetallation mechanism involving the initial complete demetallation of one domain followed by the other for both βα-rhMT and αβ-rhMT. Based on the stability of the separate domains, the β domain is predicted to demetallate first in the two-domain rhMTs. Both the α domain and the β domain were observed to bind an excess of one Cd²⁺ ion. The metallated rhMT structures were shown to have very stable conformations, but only when fully metallated. Two or more conformations were observed at low pH in the ESI-MS data, which are interpreted as arising from the presence of structure, as opposed to a random coil, in the apo-rhMT. This is the first report of the existence of a structure in the two-domain metal-free apo-MT proteins. Only at extremely low pH does the structure open fully to give the highest charge distribution, which is associated with a random coil. Pre-existing structural features in the apo-MT would explain why the metallation reactions occur so rapidly.Key words: recombinant human metallothionein-1 (rhMT1), electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), circular dichroism (CD), molecular mechanics/molecular dynamics (MM3/MD).

On a utilisé des données de spectrométrie de masse avec ionisation par électronébulisation (SM-IEN) et des calculs théoriques de modélisation moléculaire pour obtenir des informations mécanistiques, conformationnelles et spécifiques au domaine relatifs aux réactions de démétallation induites par des acides de métallothionéines humaines. Les protéines recombinantes étudiées sont les espèces α- et β-rhMT-1a, à un domaine, et les espèces βα- et αβ-rhMT-1a à deux domaines sur la base de la séquence 1a de la métallothionéine humaine. Faisant appel à un champ de forme modifié, on a pu définir pour la première fois les modèles moléculaires complets (MM3/MD) de toutes les espèces métallées et démétallées. Sur la base des modèles moléculaires, on a identifié les résidus basiques qui contribuent aux états chargés de SM-IEN. La démétallation se produit sur une très faible plage de pH. Pour les protéines à deux domaines, ces résultats sont en accord avec un mécanisme de démétallation impliquant une démétallation complète d'un domaine suivie par l'autre pour le βα-rhMT et le αβ-rhMT. Sur la base de la stabilité de chacun des domaines pris séparément, on peut prédire que des rhMT à deux domaines, le domaine β sera le premier à subir une démétallation. On a observé que le domaine α ainsi que le domaine β se lient tous les deux à un excès d'ion Cd²⁺. On a démontré que les structures rhMT démétallées sont dans des conformations très stables, mais uniquement lorsqu'elles sont complètement démétallées. Dans les données de SM-IEN du apo-rhMT à faible pH, on a observé la présence d'au moins deux conformations qui a été interprétée en fonction de la présence d'une structure par opposition à la pelote statistique. Ceci constitue le premier rapport de l'existence d'une structure dans protéines apo-MT à deux domaines et privées de métal. La structure ne s'ouvre complètement qu'à des valeurs extrêmement faibles du pH et elle conduit alors à la plus grande distribution de charge qui est associée à une pelote statistique.

Document Type: Research article

Publication date: 2007-10-01

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