Kinetic characterization of a cis- and trans-acting M²⁺-independent DNAzyme that depends on synthetic RNaseA-like functionality — Burst-phase kinetics from the coalescence of two active DNAzyme folds

Authors: Ting, Richard; Thomas, Jason M.; Perrin, David M.

Source: Canadian Journal of Chemistry, Volume 85, Number 4, April 2007 , pp. 313-329(17)

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Abstract:

This work describes the kinetics of the DNAzyme 9₂₅-11, a combinatorially selected, M²⁺-independent ribophosphodiesterase that is covalently modified with both cationic amines and imidazoles. At 13 °C, cis- and trans-cleaving constructs of 9₂₅-11 demonstrate the highest rate constants reported to date for any M²⁺-independent nucleic acid catalyst, investigated at physiological ionic strength and pH 7.5 (0.3 min^-1 for self cleavage and 0.2 min^-1 for intermolecular cleavage). In contrast to the cis-cleaving species, single-turnover experiments with the trans-cleaving species exhibit biphasic cleavage data, suggesting the presence of two conformations of the catalyst-substrate complex. Pulse-chase experiments demonstrate that both complexes lead to substrate cleavage. Under multiple-turnover conditions, the higher rate constant appears in a burst phase that decays to a slower steady state exhibiting a rate constant of 0.0077 min^-1, a value approximating that of the slow-cleaving phase seen in single-turnover experiments. Slow product release is excluded as the source of the burst phase. An integrated rate equation is derived to describe burst-phase kinetics based on the funneling of the initial population of fast-cleaving conformation into a steady-state population composed largely of the slow-cleaving conformation.Key words: RNase mimics, DNAzymes, ribozymes, kinetics, RNA cleavage.

Dans ce travail, on décrit la cinétique de la 9₂₅,11-ADNzyme, une ribophosphodiestérase M²⁺-indépendante qui a été sélectionnée d'une façon combinatoire et qui a été modifiée d'une façon covalente avec des amines cationiques ainsi que des imidazoles. À 13 °C, de tous les catalyseurs d'acide nucléique, l'entité 9₂₅,11 de clivage cis- et trans- présente la constante de vitesse la plus élevée pour une activité M²⁺-indépendante, à force ionique physiologique et à un pH de 7,5 (0,3 min^-1 pour l'autoclivage et de 0,2 min^-1 pour le clivage intermoléculaire). Par opposition à ce qui est observé avec des espèces à clivage cis-, des expériences à simple rotation avec des espèces à clivage trans- fournissent des données relatives à un clivage biphasique ce qui suggère la présence de deux conformations du complexe catalyseur substrat. Des expériences de recherche de pulsation démontrent que les deux complexes conduisent à un clivage du substrat. Dans des conditions impliquant plusieurs rotations, il semble que la constante de vitesse la plus élevée soit dans une phase explosive qui ralentit vers un état stationnaire plus lent dont la constante de vitesse est 0,0077 min^-1, une valeur qui se rapproche de celle de la phase lente du clivage observé dans les expériences à rotation unique. Une libération lente de produit est exclue comme source de la phase explosive. On a dérivé une équation de vitesse intégrée pour décrire la cinétique de la phase explosive; elle est basée sur une orientation de la population initiale de la conformation à clivage rapide dans une population d'état stationnaire formée en grande partie de la conformation à clivage lent.Mots-clés : imitation de la RNase, ADNzymes, ribozymes, cinétique, clivage de l'ARN.[Traduit par la Rédaction]

Document Type: Research article

Publication date: 2007-04-01

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