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An optimized method for intensive screening of molecules that stimulate β-defensin 2 or 3 (hBD2 or hBD3) expression in cultured normal human keratinocytes

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Abstract:

Synopsis Normal human skin controls the intrusion of microorganisms by the production of peptide antibiotics such as defensins. The aim of our study was to develop a culture model of normal human keratinocytes for optimal -defensin mRNA detection which allows the screening of molecules able to stimulate hBD2 and hBD3 without inducing pro-inflammatory cytokines. A keratinocyte culture model in 96-well plates, in high calcium medium (1.7 mm) allowed to analyze hBD2 and hBD3 mRNA expression in basal condition and after cell stimulation by products from diverse vegetal extracts. The release of IL-8 and the chemokine MIP-3 was also evaluated in cell supernatants by ELISA. Among the 184 extracts tested, 75 showed a stimulatory effect on -defensin expression: 40 on hBD2, 26 on hBD3 and nine on both defensins. Fifteen of these substances which also induced the release of pro-inflammatory cytokines were eliminated. Among the other substances, four were selected and were analyzed in a dose-dependent study ( = 4) by real-time quantitative RT-PCR and completed by a measure of MIP-3, IL-8 and IL-1 levels. These data underline the important necessity of screening result controls by a quantitative method reproduced at least three times. This new method of intensive screening allowed us to exhibit vegetal extracts that were able to stimulate epidermal -defensin expression without inducing an up-secretion of pro-inflammatory cytokines.

French
Résumé

La peau humaine normale exerce une fonction barrière contre l'intrusion de microorganismes par la production de peptides antibiotiques comme les défensines. Le but de cette étude a consistéà mettre au point un modèle de culture de kératinocytes humains normaux permettant une détection optimale des ARNm des défensines en général, et adapté au screening de molécules aptes à stimuler les défensines épidermiques hBD2 et hBD3 en particulier, sans induire de cytokines pro-inflammatoires. Un modèle de culture de kératinocytes en plaques 96 puits, en milieu riche en calcium (1,7 mm) permet une analyse de l'expression des ARNm de hBD2 et hBD3 en condition basale et après stimulation par divers extraits végétaux. La sécrétion d'IL-8 et de la chimiokine MIP-3α a étéévaluée dans les surnageants de culture par ELISA. Parmi les 184 extraits testés, 75 montrent un effet stimulant sur l'expression des β-défensines : 40 ont un effet sur hBD2, 26 sur hBD3 et 9 sur les 2 types de défensines. Quinze de ces actifs qui induisent aussi la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires ont étééliminés. Parmi les autres molécules, 4 ont été sélectionnées pour faire l'objet d'une étude de leurs effets-doses (n = 4) sur l'expression des β-défensines par une technique quantitative de RT-PCR en temps réel. Cette étude est complétée par le dosage des cytokines IL-1α, IL-8 et MIP-3α. Les résultats obtenus soulignent l'importante nécessitée de contrôler au moins trois fois par une méthode quantitative les résultats d'un screening. Cette nouvelle méthode de screening intensif nous a permis de mettre en évidence des extraits végétaux capables de stimuler les défensines épidermiques sans induire de cytokines pro-inflammatoires.

Keywords: cytokine; keratinocyte; screening; vegetal extract; β-defensin

Document Type: Research Article

DOI: http://dx.doi.org/10.1111/j.1467-2494.2005.00262.x

Affiliations: 1: Inserm U346, Clinique Dermatologique, Hôpital E. Herriot, Lyon 2: COLETICA, Lyon 3: YSL Beauté, Neuilly sur Seine, France

Publication date: June 1, 2005

bsc/ics/2005/00000027/00000003/art00003
dcterms_title,dcterms_description,pub_keyword
6
5
20
40
5

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